Name: Electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: تعلم تقنية الكهرباء الحيوية لإدخال الجزيئات الكبيرة إلى اللحمة المتوسطة الجمجمية في أجنة Xenopus laevis. تتيح هذه الطريقة التحكم الزماني والمكاني في دراسة تطور الوجه والجمجمة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن ممتنون لPapalopulu نانسي وBoyan بونيف للحصول على المساعدة مع electroporation القيطم. كما نشكر مارك ديون لقراءة نقدية ، وجون جرين جيريمي الينجفورد للمناقشات مفيدة وأفراد المختبر ليو لدعمهم. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من BBSRC (BB/E013872/1) ويلكوم ترست (081880/Z/06/Z) لKJL.

جزء 1A. معدات المجهر : تستقيم نطاق ستيريو مع تشريح الهدف منخفضة الطاقة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجهد / مولد نبض : BTX ECM 830 Electroporation الموجة ساحة النظام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة مجتذب : P - 87 Micropipette بولير (سوتر شركة الصك ، CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناور : الخشنة ، أو مجتمعة الخشنة والناعمة اعتمادا على الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette حامل : أدوات العلوم الجميلة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القطب : محلية الصنع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation الغرفة : محلية الصنع </li></ul> على شكل حرف L الأقطاب : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 8 سم من نقاء عالية سلك التنغستن 0.4 ملم (Goodfellow) ، ويضعوا في منتصف حقنة 1ml باستخدام المعجون (نستخدم بلو تاك). ترك 4 سم سلك التنغستن يتعرض من غيض من غيض المحاقن والانحناء في شكل - L ، 1 سم من نهاية (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم غيض بحيث نهاية التدابير 0.5 ملم في الطول. Tتلميح له هو نهاية القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الفائض موازية لسلك التنجستن حقنة واستخدامه لتوصيل مولد نبض كهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية صنع زوج من الأقطاب الكهربائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق الأقطاب إلى مربع موجة مولد نبض عبر الكابلات العاصمة. </li></ol> Electroporation الغرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسفل خط 90 ملم مع صحن 5 ~ البلاستيسين غير سامة ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق electroporation مع وسائل الاعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام رقم 5 ساعاتي ملقط نحت جيدا على شكل حرف T (الشكل 2). وينبغي أن البئر طويلة قياس ~ 2 مم × 2 مم x 10 مم والقصير 2 مم ~ × 2 مم × 5 مم. يمكن غسل الطبق electroporation وإعادة استخدامها. </li></ol> جزء 1B. الكواشف الحمض النووي أو الجزيئات المشحونة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes : 1 4 ملم واسعة "لفترة طويلة البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية (WPI ، TW100 - F) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الإعلام : عادي البرمائيات وسائل الإعلام (NAM) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &gt; 10 X الأسهم : 1100 ملي كلوريد الصوديوم ، 20بوكل ملي و 10 ملي كا (NO 3) 2 • 4H 2 O ، 1 ملم EDTA. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 X حركة عدم الانحياز : خفف من 10X العازلة ، الأسهم بنسبة 0.1 ملي NaHCo 3 و 0.2 ملي نا 3 ص 4. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القيطم المورق الضفادع الصغيرة ، المرحلة 28 </li></ul> الحمض النووي التحضير : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البلازميدات التعبير باستخدام بروتوكولات قياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الحمض النووي للتركيز النهائي من 1 ميكروغرام / ميكروليتر في nuclease مجانا H 2 0. </li></ol> * لقد كان النجاح مع ناقلات تحتوي على مروج CMV قوية ، مثل pCS2 + [16]. لتحليل النسب ، ونحن عادة ما تتضمن الحمض النووي الترميز الخضراء بروتين فلوري (GFP pCS2 +) عند تركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / ميكروليتر. كما تم اختبار تركيز الحمض النووي [بين 0،1-3 ميكروغرام / ميكروليتر. وجدنا أن تركيزات أقل من الخلايا ميكروغرام / ميكروليتر 0.8 المسمى غير فعالة ، في حين أن تركيز الحمض النووي أكبر من 2 ميكروغرام / م &amp;ش ؛ لم يكن ل تحسين الكفاءة electroporation]. Morpholino إعداد قليل النوكليوتيد : (ملاحظة : يجب أن المنظمات الأعضاء fluoresceinated (3' - carboxyfluorescein تعديل) أو اتهامات غير ذلك) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [أليغنوكليوتيد] Resuspend morpholino (موس) (Genetools ، <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> ) بتركيز 2 مم في nuclease مجانا H 2 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة حرارة حل السهم عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع للتركيز النهائي من 0.5 ملم في المياه مجانا nuclease. </li></ol> تم اختبار * 0.1 - 1MM MO الحلول. وكانت 0.5 ملم حلول MO كافية لخلايا اللحمة المتوسطة electroporation كثيرة. Micropipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد micropipettes من الزجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (1 ملم واسعة ، 4 "طويل ، لا WPI. TW100 - F). مجتذب استخدام إبرة لإعداد micropipettes مع تفتق لونغ 8-12 ملم وغيض الغرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غيض سحق ~ 2 مممن طرف باستخدام ملقط ، وخلق فاصل خشنة. </li></ol> وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الاعلام الحضانة : تحضير 04/03 عادي الطازجة البرمائيات وسائل الإعلام (NAM) 1X من الأسهم. إضافة 0،025 ملغ / مل الجنتاميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الاعلام Electroporation : على النحو الوارد أعلاه ، مع 0.1 ٪ بنزوكاين (سيغما ، 06950). </li></ol> 2. Electroporation Micropipette الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء مع micropipette 1 ~ حل حقن ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آمن micropipette في micromanipulator ونعلق على microinjector (Picospritzer الثاني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في زاوية 50 درجة micropipette من الطاولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة ضغط الحقن في 20 PSI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة micropipette لضخ 30 NL في النبضة. </li></ol> إعداد الشرغوف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير اليرقات المرحلة التي يحتضنها القيطم 28 electroporation في وسائل الإعلام لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الى غرفة تخدير الشرغوف electroporation شغلها مع وسائل الاعلام electroporation. موقف الجنينضمن فترة طويلة جيدا أن مساند الرأس في مفترق - T مع الجانب الظهري أسفل والجانب البطني المكشوفة. يجب أن يكون الرأس مرتفع قليلا مقارنة مع الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط ، وتأمين بلطف الشرغوف بشكل جيد مع المناطق المحيطة البلاستيسين. (ملاحظة : إذا لم يتم تأمين الشرغوف ، فإنه قد نشل والاتصال الكهربائي خلال electroporation في هذه الحالة تجاهل الشرغوف كما سيتم أنسجة الوجه أضرار جسيمة) </li></ol> Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج غيض micropipette الخلفي فورا للغدة الاسمنت واللحمة المتوسطة في الوجه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 30 NL حل في اللحمة المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة بسرعة نصائح القطب الموازي للرئيس الجنين (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 8 50 مللي ، والبقول 20mV مربع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع عن الأقطاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط الافراج الشرغوف بعناية من جانب ونقل إلى 03/04 حركة عدم الانحياز ، 0،025 ملغ / مل الجنتاميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن المحتضنة الشراغيف في 04/03 حركة عدم الانحياز ، 0،025 ملغ / مل overnight ، أو لفترة أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الاجنة لelectroporation كفاءة من خلال الفحص المجهري مضان بعد 24 ساعة. </li></ol> 3. ممثل النتائج : استخدام جزيئات الفلورسنت يسمح فحص الأجنة electroporated سهلة. الشكل 4 يوضح دفعة نموذجية من MO electroporated الشراغيف ~ 12 و 48 و 96 ساعة بعد electroporation ، حضنت ب 14.5 درجة مئوية. باستخدام المجهر مضان ، يمكن تصور المنظمات الأعضاء على الفور بعد electroporation وتستمر لعدة أيام بعد electroporation. في تجربتنا ، مضان هو واضح في هذه المرحلة ضعيف 46 (~ 5 أيام في وقت لاحق). في الغضاريف ، يقلل بشكل كبير مضان بعد ظهور تمايز (~ ش 42) ، ومع ذلك ، استمرت MO مضان بقوة أكبر في أنواع الخلايا الأخرى مثل الأديم الباطن البلعوم. مضان المجهري تبين أن تدرج في الأنسجة [أليغنوكليوتيد] القحفي عدة بما في ذلك الغضروف. قليل النوكليوتيد مضان جan غالبا ما يكون تصور في الأنسجة على جانبي الرأس. وهذا هو الأرجح بسبب الانتشار السريع للحقن محلول في جميع أنحاء اللحمة المتوسطة في القحفي فضفاضة قبل electroporation. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg"> الشكل 1 كهربائية محلية الصنع. ويرد على شكل حرف L سلك التنغستن الى حقنة 1 مل به غير سامة أو الطين المعجون. (أ) وصول القطب التدابير 5 ملم. (ب) أرفق زوج من الأقطاب ، مثل أن مصطلحات تسير في شكل مواز. وترد إلى مولد كهربائي نبض بواسطة الكابلات العاصمة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg"> الشكل 2 غرفة Electroporation. (أ) يتم تعبئة 90 مم طبق تصطف مع البلاستيسين مع وسائل الإعلام وغرفة منحوتة على شكل حرف T مع ملقط للا ساعاتي 5. (ب) على الجانب البعيد اجراءات X 2 ملم 2 ملم X10 ملمفي حين أن التدابير القصيرة 2 مم X 2 مم X 5 مم. رأس الجنين تقع في الجانب ، T - بطني حتى مفرق. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg"> الشكل 3 يوضح الإجراء التخطيطي electroporation. وضعت سانت الشرغوف في 28 غرفة electroporation ، حتى الجانب البطني. يتم إدراج Micropipette في الوجه الغدة اللحمة المتوسطة الأسمنت المصدر. حقن. تتم إزالة Micropipette وتتماشى على شكل حرف L أقطاب المرافقة موازية الرأس. تطبيق eight 50 مللي ، 20 بالسيارات البقول مربع. التراجع عن الأقطاب. تنمو الشراغيف المراحل المطلوبة. المنظمات الأعضاء أو يتصور GFP التعبير باستخدام المجهر مضان. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg"> الرقم الشراغيف الممثل 4 12 (أ) و 48 (B) ، و 96 (C) ساعة electroporation آخر (المراحل 30 و 34 و 44 على التوالي). يمكن (A "- B") يمكن تصور نيون MO داخل القحفي اللحمة المتوسطة في الأيلوفاق 30 و 34. ويمكن الكشف عن مضان في غضاريف في المرحلة 44 (رأس السهم ، C' - C ") ، والقناة الهضمية وautofluorescent للغاية.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
<li>Falk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Electroporation+in+vivo+within+the+Intact+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).</li>
<li>Kuriyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tsukushi+controls+ectodermal+patterning+and+neural+crest+specification+in+Xenopus+by+direct+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22of+BMP4+and+X-delta-1+activity.+Development%22%5BJournal%5D)">Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation.</a> of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).</li>
<li>Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+effective+gene+knock-down+in+early+chick+embryos+using+morpholinos+but+not+pRFPRNAi+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors.</a> Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).</li>
<li>Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> Embo. J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109, 205-216 (2002).</li>
<li>Grossin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+rat+articular+cartilage+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation.</a> Faseb. J. 17, 829-835 (2003).</li>
<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
<li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم تعارض في المصالح.

في هذا الفيديو ، وقد أثبتنا جدوى إيصال الجينات electroporation بوساطة اللحمة المتوسطة في الوجه من الشراغف الضفدع. باستخدام هذا النهج ، يمكننا تجاوز الآثار التنموية في وقت مبكر من التلاعب وظيفة الجين مما يسمح لنا استهداف الأنسجة عند نقاط محددة وقت لاحق. دراستنا تظهر أن يمكن أن يتأثر السكان غير متجانس من خلايا اللحمة المتوسطة القحفي ، مما يسمح لنا لدراسة نسب الخلايا electroporated فضلا عن متطلبات الحكم الذاتي للبروتينات الخلية في المصالح. تعيش جنبا إلى جنب مع التصوير ، يمكننا استخدام هذا النهج لدراسة وظائف الجينات ، بمرور الوقت ، أثناء تطوير القحفي. هذا الأسلوب الرواية الضوء على قابلية الإستطراق من القيطم لدراسة organogenesis. ونحن نتوقع أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها على نطاق واسع لدراسة التشكل وتمايز الأنسجة الأخرى كذلك.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation وسيلة فعالة لإيصال الحمض النووي وغيرها من الجزيئات المشحونة في الأنسجة عند نقاط زمنية محددة وفي أماكن محددة. على سبيل المثال ، تم استخدام electroporation مع النجاح الكبير لدراسة التنمية العصبية وشبكية العين في القيطم والدجاج والفأر 1-10. ومع ذلك ، فمن المهم أن نلاحظ أنه في كل هذه الدراسات والمحققين لا تستهدف الأنسجة الناعمة. لأن نحن مهتمون في التنمية القحفي ، وتكييفها لدينا طريقة لاستهداف اللحمة المتوسطة في الوجه. وجدنا أننا عندما بحثت في الأدب ، لدهشتنا ، وتقارير عدد قليل جدا من نقل الجينات في الأنسجة الغضروفية ناجحة. وكانت غالبية هذه الدراسات دراسات العلاج الجيني ، مثل تسليم سيرنا أو البروتين إلى خطوط الخلية مكون للغضروف ، أو النماذج الحيوانية من التهاب المفاصل 11-13. في الأنظمة الأخرى ، مثل الدجاج أو الماوس ، وقد electroporation اللحمة المتوسطة من الوجه تحدي (communicat الشخصيةالأيونات ، دائرة التنمية الجمجمة ، بوكل). افترضنا أن electroporation في الأنسجة الغضروفية وprocartilaginous في القيطم قد يعمل على نحو أفضل. في دراساتنا ، وتبين لنا أن نقل الجينات في غضاريف الوجه يحدث بكفاءة في المراحل المبكرة (28) ، وعندما تتكون يزال منشم الوجه الأنسجة اللينة قبل التمايز الغضروف. القيطم هو نظام للوصول للغاية لتحليل الفقاريات التنمية القحفي. هياكل القحفي بسهولة أكثر وضوحا في القيطم مما كانت عليه في أي نموذج الفقاريات الأخرى ، في المقام الأول لأن الأجنة المخصبة القيطم خارجيا ، مما يسمح للتحليل في المراحل المبكرة ، وتسهيل التصوير العيش في قرار خلية واحدة ، فضلا عن إعادة استخدام الأمهات 14. بين النماذج الفقاريات النامية خارجيا ، القيطم هو أكثر فائدة للتحليل القحفي من الزرد ، والقيطم اليرقات تكون أكبر وأسهل في ديssect ، ومنطقة نامية الوجه هو أكثر يسرا لتصوير ما يعادل أكثر من منطقة في الأسماك. بالإضافة إلى ذلك ، القيطم تطويريا هو أقرب للإنسان من الزرد (~ 100 مليون سنة أوثق) 15. أخيرا ، في هذه المراحل ، الشراغف القيطم تتسم بالشفافية ، والتعبير المتزامنة من البروتينات الفلورية أو الجزيئات سيسمح التصور السهل للغضاريف النامية. ونحن نتوقع أن هذا النهج سوف تسمح لنا بسرعة وكفاءة اختبار الجزيئات مرشح في النظام النموذجي في الجسم الحي.

غضاريف تطوير القحفي على اتصال وثيق مع أنسجة أخرى ، ويصعب التلاعب في الحيوانات الحية. نحن نستخدم electroporation لتقديم الأدوات الجزيئية أثناء نمو الهيكل العظمي القحفي مع تجاوز آثار الجنينية المبكرة. وسوف تسمح لنا هذه المقاربة لاختبار كفاءة المرشح جزيئات<em&gt; في الجسم الحي.</em

Electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة

يُعد التثقيب الكهربائي طريقة فعالة لإيصال الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) وغيرها من الجزيئات الكبيرة المشحونة إلى الأنسجة في نقاط زمنية ومواقع دقيقة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال الجزيئات الكبيرة المشحونة كهربائياً إلى الميزنكيم القحفي الوجهي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وضع جنين في المرحلة 28 تحت التخدير داخل غرفة التثقيب الكهربائي. والخطوة التالية هي الحقن المجهري للمحلول الذي يحتوي على الجزيئات الكبيرة المشحونة في الميزنكيم القحفي الوجهي.ويتبع ذلك مباشرة تطبيق تيار كهربائي، مما يؤدي إلى إدخال النيوكليوتيدات المشحونة إلى الخلايا. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تصوير الأنسجة التي خضعت للتثقيب الكهربائي باستخدام المجهر الفلوري. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات في أنسجة الوجه والجمجمة.يمكن تحليل هذه النتائج داخل الجسم الحي (in vivo) أو في الأنسجة المثبتة باستخدام الفلورة، أو المجهر، أو الكيمياء النسيجية المناعية. وتتمثل الميزة الرئيسية للتثقيب الكهربائي مقارنةً بالطرق الحالية مثل الحقن المجهري والطفرات في التحكم النسيجي والزمني في أدواتنا الجزيئية، وستقوم جاكي تابلر، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، باستعراض إجراءاتنا اليوم. تتكون مجموعة الأقطاب الكهربائية ذات الشكل L المطلوبة لهذا الإجراء من سلك تنگستن عالي النقاء بقطر 0.4 millimeter لكل قطب كهربائي؛ ابدأ بقص ثمانية سنتيمترات من السلك.بعد ذلك، وباستخدام مادة لاصقة مثل blue tack، يتم تثبيت حقنة سعة 1 milliliter عند نقطة منتصف سلك التنجستن، مع ترك 4 centimeters من السلك مكشوفة من طرف الحقنة. ثنِ الطرف على شكل حرف L على بُعد 1 centimeter من النهاية. ثم قص الطرف بحيث يبلغ طول النهاية 0.5 centimeters.يمثل هذا الطرف نهاية القطب الكهربائي، حيث يتم تمديد سلك التنجستن الزائد بشكل موازٍ للمحقنة. سيُستخدم هذا الطرف لتوصيل مولد نبضات القطب الكهربائي بعد تجهيز القطب الثاني. قم بتثبيت زوج الأقطاب الكهربائية معاً باستخدام شريط لاصق بحيث تمتد نهايات الأقطاب الكهربائية بشكل موازٍ، وبمسافة سنتيمتر واحد بينهما.أخيرًا، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد نبضات موجة مربعة عبر كابلات التيار المستمر DC. ولتحضير غرفة التثقيب الكهربائي المصنعة خصيصًا، قم بتبطين قاع طبق بقطر 90 millimeter بطبقة يبلغ سمكها حوالي 5 millimeter من صلصال نمذجة المشاهد الجبسية غير السام. املأ الطبق بوسط التثقيب الكهربائي بحيث يتم غمر الصلصال الجبسي بالكامل.ثم استخدم ملقط ساعة رقم 5 لنحت بئر على شكل حرف T في المشهد الجصي لتشكيل عملية التثقيب الكهربائي. يجب أن تبلغ قياسات الجانب الطويل من البئر حوالي 2 mm × 2 mm × 10 mm، والجانب القصير 2 mm × 2 mm × 5 mm. وتتكون الماصات الدقيقة المستخدمة في هذا الإجراء من شعيرات زجاجية سيليكاتية.استخدم جهاز سحب الإبر لتحضير ماصات دقيقة ذات استدقاق يتراوح طوله بين 8 إلى 12 ملم وطرف دقيق، ثم قم بسحق الطرف على بُعد حوالي 2 ملم من النهاية باستخدام ملقط، مما يؤدي إلى إحداث كسر متعرج لتجهيز الماصة الدقيقة. أولاً، املأ الماصة بحوالي 1 µL من محلول الحقن، والذي يحتوي في هذا العرض التوضيحي على oligonucleotides مُوسومة فلورياً. بعد ذلك، قم بتثبيت الماصة الدقيقة في جهاز تحريك دقيق مع إمالتها بزاوية 50 درجة عن سطح الطاولة.اضبط ضغط الحقن عند 20 PSI وعاير الماصة الدقيقة لحقن 30 liters لكل نبضة. وتحضيراً لعملية التثقيب الكهربائي، قم بتخدير يرقات xeno في المرحلة 28 عن طريق تحضينها لمدة خمس دقائق. ثم انقل الشرغد المخدر إلى غرفة التثقيب الكهربائي في وسط التثقيب الكهربائي، وهو وسط البرمائيات العادي الذي يحتوي على 0.1% Benzocaine.يتم ملؤه بوسط التثقيب الكهربائي. إن الجزء الأكثر دقة في هذا الإجراء هو إدخال الماصة الدقيقة في الشرغوف. لذا، ولضمان النجاح، يجب تثبيت الجنين بإحكام شديد، ثم تطبيق التيار الكهربائي بسرعة بعد الحقن الدقيق.ضع الجنين داخل البئر الطويل بحيث يستقر الرأس في الوصلة على شكل T. مع توجيه الجانب الظهري للأسفل وتعريض الجانب البطني، يجب أن يكون الرأس مرتفعًا قليلاً مقارنة بالذيل؛ وباستخدام الملاقط، ثبت الشرغوفة برفق داخل البئر باستخدام مشهد الجبس المحيط. من المهم تثبيت الشرغوفة لمنعها من الارتجاف أثناء عملية التثقيب الكهربائي، الأمر الذي قد يؤدي إلى حدوث تلف شديد في أنسجة الوجه.لبدء هذا الإجراء، أدخل طرف الماصة الدقيقة خلف الغدة الإسمنتية مباشرة وفي الميزنشيم الوجهي. احقن 30 nanoliters من المحلول في الميزنشيم، ثم اسحب الماصة الدقيقة. قم بمحاذاة أطراف القطب الكهربائي بسرعة بشكل موازٍ لرأس الجنين، وقم بتطبيق ثماني نبضات مربعة بقدر 20 millivolt ولمدة 50 millisecond لكل نبضة.بعد ذلك، قم بسحب الأقطاب الكهربائية باستخدام الملقط. أخرج شرغف الضفدع بعناية من البئر. ثم استخدم مصّة لنقل الشرغوف إلى محلول nom بتركيز 0.025 milligrams per milliliter.يمكن تحضين شرغوف Gentamycin في هذا الوسط طوال الليل أو لفترة أطول بعد مرور 24 ساعة. يتم فحص الشرغوف بواسطة المجهر الفلوري للتأكد من كفاءة التثقيب الكهربائي. يتيح استخدام الجزيئات الفلورية سهولة فحص الأجنة التي خضعت للتثقيب الكهربائي.يوضح هذا الشكل مجموعة نمطية من شرغوفات تم إجراء التثقيب الكهربائي لها باستخدام قليلات النيوكليوتيد المورفولينية بعد حوالي 1248 و96 ساعة من التثقيب الكهربائي، وذلك في المراحل 30 و34 و44 على التوالي. ويمكن رؤية قليلات النيوكليوتيد المورفولينية الفلورية داخل المنطقة القحفية الوجهية في المرحلتين 30 و34.في المرحلة 44، يمكن الكشف عن الفلورة في الغضاريف المشار إليها برؤوس السهام البيضاء. أما المنطقة ذات الفلورة الذاتية العالية فهي الأمعاء. باتباع هذا الإجراء، يمكننا تتبع سلالة الخلايا الكهربائية بالإضافة إلى المتطلبات الجزيئية للبروتينات محل الاهتمام.يمكن دمج هذا النهج مع تقنيات التصوير الحي لدراسة وظيفة الجينات بمرور الوقت أثناء التطور القحفي الوجهي.

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وحيدة الخلية electroporation (SCE) هي تقنية متخصصة تسمح تسليم الحمض النووي أو غيرها من الجزيئات في الخلايا الفردية داخل الأنسجة سليمة ، بما في ذلك الأعمال التحضيرية الجسم الحي. نحن هنا من التفصيل الداخلي لSCE صبغة الفلورسنت أو DNA البلازميد في الخلايا العصبية في الدماغ سليمة من الشرغوف القيطم المورق.

وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

يصف هذا الإجراء وسيلة لعزل والثقافة الجهاز الفئران كورتي مع أو بدون حوف ودوامة لولبية العقدة العصبية. نظهر أيضا طريقة للتعبير عن الجينات مراسل الخارجية في جهاز ازدراع كورتي بواسطة electroporation.

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

electroporation في الرحم تسمح للتسليم في الجين سريعا مكانيا وزمانيا الطريقة التي تسيطر عليها في النظام العصبي المركزي النامية (CNS). نحن هنا وصف للتكيف كبيرة في بروتوكول electroporation الرحم التي يمكن استخدامها لتوفير بنيات التعبير في عدة مجالات CNS الجنينية ، بما في ذلك الدماغ البيني ، telencephalon والشبكية.

كفاءة توصيل الجينات في الجهاز العصبي المركزي متعددة باستخدام الأراضي في الرحم Electroporation

يوصف أسلوب نقل الجينات في مخ الفأر النامية باستخدام أسلوب فريد الجراحية وشكل خاص من الأقطاب الكهربائية. هذا الأسلوب الفريد يسمح ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد الزمان والمكان ، والتي ستساعد الكثير من علماء الأعصاب في دراسة تطور الدماغ.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

لإجراء تقييم سريع وظيفة الجينات في تطور قشرة الدماغ، ونحن تصف الأساليب التي تنطوي...

أساليب لدراسة التشكل متعلق بالخلايا العصبية:<em&gt; خارج الحي</em&gt; رني Electroporation في اللحاء المخي الفئران الجنينية

كيف يتم إنشاء شبكات الخلايا العصبية في الدماغ الجنينية هي المسألة الأساسية في علم الأعصاب التنموي. هنا نحن الجمع بين تقنية electroporation مع الأدوات الوراثية الرواية، مثل لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن، البلازميدات وPiggyBac بوساطة نظام تبديل الحمض النووي في الدماغ المؤخر الطيور لتسمية interneurons الظهرية وتتبع التوقعات محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل النمو المختلفة.

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

سطح حنوني هي منطقة فريدة من نوعها السلف في الجهاز العصبي المركزي الذي يتلقى اهتماما متزايدا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة للتلاعب الجيني السريع في هذه المنطقة السلف باستخدام أسلوب التثقيب الكهربائي تعديلها. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيقات الخلوية والجزيئية الأنساب الخلية ومسارات الإشارات المشاركة في تمايز الخلايا واستجلاء مصير وخصائص الخلايا الوليدة.

حديثي الولادة حنوني التثقيب الكهربائي السطحية

نقدم طريقة تصف عزل واستزراع استنخاذ القوقعة الصناعية من الأذن الداخلية للفأر الجنينية.  نوضح أيضا طريقة لنقل الجينات إلى مستخلصات القوقعة الصناعية عبر التثقيب الكهربائي ذو الموجة المربعة. تمكن ثقافة الزرع في المختبر إلى جانب تقنية نقل الجينات الباحثين من دراسة تأثيرات تغيير التعبير الجيني أثناء التطوير.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

مضاعفة في الكهربائي الرحم يسمح استهداف مجموعات الخلايا التي يتم فصل مكاني وزمنيا. هذه التقنية مفيدة لتصور التفاعلات بين تلك الخلايا التي تستخدم البروتينات الفلورية في الظروف العادية ولكن أيضا بعد التجارب الوظيفية ل الجينات التي تثير الاهتمام.

مضاعفة في Electroporation الرحمية لاستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً

هنا ، نقدم بروتوكولا يجمع بين التثقيب الكهربائي في الجسم الحي وإزالة التعصيب في عضلة الرافعة القحفية الطويلة (LAL). يتيح هذا الإجراء دراسة الدور المحتمل للبروتينات المشتقة من العضلات في تجديد المشبك العصبي العضلي.

مجتمعة في الجسم الحي التثقيب الكهربائي وإعادة التعصيب على المدى القصير للعضلة الهيكلية الرافعة القحفية Auris Longus

هنا ، نقدم التلاعب الجيني الحاد للعضيات القشرية البشرية المقطعة عن طريق التثقيب الكهربائي. هذه النماذج العضوية القشرية قابلة بشكل خاص للحقن حيث يمكن التعرف بسهولة على الهياكل الشبيهة بالبطين بعد التقطيع ، مما يتيح التحقيق الوظيفي للتطور القشري البشري ، واضطرابات النمو العصبي ، والتطور القشري.

التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة لدراسات وظيفة الجينات

تعلم تقنية الكهرباء الحيوية لإدخال الجزيئات الكبيرة إلى اللحمة المتوسطة الجمجمية في أجنة Xenopus laevis. تتيح هذه الطريقة التحكم الزماني والمكاني في دراسة تطور الوجه والجمجمة.

Electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة

استكشف المزيد من الفيديوهات