بروتوكولات لتلقيح المهبل وجمع العينات في النموذج التجريبي للماوس المبيضات المهبل

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار مشكلات إجرائية محددة مرتبطة باستخدام النموذج الحيواني التجريبي لداء المبيضات المهبلي كوسيلة لتحديد العبء الفطري المهبلي ، وكذلك لاستخدام الخلايا المهبلية أو اللمفاوية في فحوصات محددة مثل المقايسات المناعية والنسيجية. سيتم تحقيق ذلك من خلال إظهار تقنية التلقيح المهبلي أولا على الفئران المعالجة بالإستروجين. بعد ذلك ، بعد القتل الرحيم للفأر ، سيتم إجراء غسل مهبلي لاستعادة المبيضات.

ثم سيتم استخراج الأنسجة المهبلية و / أو الغدد الليمفاوية المهبلية. يمكن رؤية سائل الغسيل مجهريا لإظهار المبيضات المرتبطة بالخلايا الظهارية المهبلية أو طلاءها على أجار لتحديد العبء الفطري المهبلي. يمكن أيضا استخدام مسحة الجزء الخلوي لتلطيخ الخلايا الظهارية والخلايا اللمفاوية.

لذا فإن الميزة الرئيسية لإظهار هذه التقنية هي أن مستخدمي النموذج الحيواني لالتهاب المهبل يمكنهم القيام بذلك بكفاءة وفعالية أكبر. والأسئلة الرئيسية التي يتم الإجابة عليها عبر هذه التقنية هي في مجال التهاب المهبل والبيئة وتجيب على الأسئلة الرئيسية مثل الاستجابات المناعية للمضيف ، والتوزيع الخلوي ، وفعالية الأدوية ، وفعالية العلاج المناعي ، وكذلك آثار التحصين وإظهار التقنية. اليوم سيكون طالب دراسات عليا في مختبري, جونكو يانو, لإصابة فأر ب C albicans بعد ثلاثة أيام من إعطاء حقنة بيتا استراديول.

ابدأ بتثبيت الماوس على سطح gRED مسطح حتى يمسك به. ثم أمسك قاعدة الذيل بإصبعين وارفع الورك لأعلى بحيث تتجه فتحة المهبل نحوك. أدخل طرف الماصة بعمق حوالي خمسة ملليمترات في التجويف المهبلي والماصة حتى 20 ميكرولترا من تعليق اللقاح.

أكمل هذه الخطوة بأسرع ما يمكن وبلطف لتقليل الضيق في الماوس. بعد فترة الحضانة المرغوبة ، قم بالقتل الرحيم للحيوان وفقا للبروتوكول الخاص بمنشأتك. ثم بإصبعين ، أمسك الفأر لأسفل من قاعدة الذيل حتى تتعرض فتحة المهبل بماصة.

أدخل 100 ميكرولتر من PBS المعقم في تجويف المهبل ، ومع الشفط والتحريض المتكرر ، قم بإجراء الغسيل. إذا أصبح طرف الماصة مسدودا بالخلايا، فقم بتوزيع الخلايا المعوقة واستمر في تدمير البرامج المتبقية من PBS. اجمع سائل الغسيل في أنبوب طرد مركزي صغير.

بعد إجراء غسل المهبل ، ضعي الفأر على ظهره وأشبع منطقة الفخذ بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام زوج من الملقط ، ارفع فتحة المسالك البولية لأعلى حتى تصبح فتحة المهبل مكشوفة. أدخل زوجا من الملقط المنحني في تجويف المهبل وحدد موقع عنق الرحم مع الحفاظ على قبضة قوية بالملقط.

استخرج عنق الرحم من خلال التجويف المهبلي ، واستئصال المهبل من قاعدة فتحة المهبل ، ثم قم بإزالة عنق الرحم من المهبل بمقص جراحي. نظرا لأن الأنسجة المهبلية ملتوية ، اقلبها للحفاظ على الاتجاه الأصلي أو فتحها في ورقة عن طريق عمل شق جانبي لاستئصال العقدة القطنية مع وجود على ظهره. تشبع البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.

قم بعمل شق جانبي بدءا من أسفل البطن إلى الصدر وفضح الأعضاء الداخلية باستخدام زوج من الملقط في كلتا يديك. حرك الأمعاء لأعلى حتى تصبح الأوعية الدموية المركزية مرئية. حدد موقع الوريد المشي القديم السفلي والشريان الأورطي البطني.

يمكن تحديد زوج من الغدد الليمفاوية القطنية بجوار الشريان الأورطي البطني الموجود في منتصف الطريق تقريبا بين أصل الشرايين الكلوية والحرقفية المشتركة. يمكن تمييز هذه الغدد الليمفاوية بصريا عن الأنسجة الدهنية من خلال قوامها المرن وهي أخف وزنا وأكثر غموضا في اللون مقارنة بالأنسجة الدهنية. كما أنها أكبر بشكل ملحوظ في المصابة مقارنة بالحيوانات غير الملقحة.

قامت باستئصال الغدد الليمفاوية عن طريق وضع ملقط صغير تحت العقدة ثم سحبها برفق لفصلها عن الأنسجة المحيطة. بعد استئصال الأنسجة ، انقل الغدد الليمفاوية إلى شاشة شبكية سلكية معقمة موضوعة داخل طبق بتري زجاجي معقم يحتوي على حوالي 10 مل من محلول ملح هانك المتوازن. لعزل الخلايا اللمفاوية، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب.

ما تتكون الأجزاء الخلوية لسائل الغسيل المهبلي من الفئران التي تم تلقيحها قبل أربعة أيام على الأقل من خلايا المبيضات الظهارية والتسلل الخلوي كما هو موضح هنا بواسطة الفحص المجهري الرطب. يمكن التعرف على المبيضات من خلال وجود PHA وكذلك الخميرة. هنا يتم تلطيخ مستحضرات مسحة سائل الغسيل المهبلي.

استخدام تقنية مسحة عنق الرحم لفحص الخلايا الظهارية وتسلل الكريات البيض التي تكون خلاياها الرئيسية هي العدلات ، كما يمكن تحديدها بواسطة فصوص التراكلير. يتم اكتشاف عدد قليل جدا من العدلات ، إن وجدت ، في الفئران غير الملقحة. يوضح هذا الشكل مثالا على العبء الفطري المهبلي.

يتم جمع سائل الغسيل المهبلي في نقاط زمنية محددة ويتم زراعته لتعداد CFU. في هذا المثال ، تم جمع السائل في اليوم الخامس بعد التلقيح ، بشكل متسلسل ، مخفف مطلي ، وتحضنه لمدة 48 ساعة. ثم يتم حساب المستعمرات ويستمر الاستعمار المهبلي أو العدوى بالمبيضات لأسابيع في الفئران الملقحة المعالجة بالإستروجين.

في حين أن المبيضات تفشل في إثبات الاستعمار المهبلي في الفئران الملقحة غير المعالجة بالإستروجين ، تظل الفئران المعالجة بهرمون الاستروجين سلبية للمبيضات طوال الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء غسل المهبل إما مرة واحدة على فئران منفصلة في كل نقطة زمنية أو طوليا في نفس الفئران تحت التخدير. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر كبح جماح بشكل آمن لتجنب صدمة المهبل ، ويرجى أخذ الوقت اللازم للغسيل جيدا للحصول على عبء فطري مهبلي دقيق عند استخراج الأنسجة المهبلية.

استخدم PBS الثابتة لمنعها من الجفاف ، ويرجى الحرص على عدم إتلاف الأوردة والشرايين الرئيسية عند إزالة الغدد الليمفاوية وأثناء معالجة خلايا العقدة الليمفاوية ، احتفظ بها على الجليد أو عند أربع درجات للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نموذج الفأر التجريبي لالتهاب المهبل المبيضات لتحديد العبء الفطري المهبلي بشكل متكرر واستئصال الأنسجة المهبلية أو اللمفاوية لمقايسات مناعية أو نسيجية محددة.