بروتوكولات لتلقيح المهبل وجمع العينات في النموذج التجريبي للماوس المبيضات المهبل

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح مشكلات إجرائية محددة مرتبطة باستخدام النموذج الحيواني التجريبي لداء المبيضات المهبلي كوسيلة لقياس العبء الفطري المهبلي، وأيضاً لاستخدام الخلايا المهبلية أو اللمفاوية في فحوصات محددة مثل الفحوصات المناعية والنسيجية. سيتم تحقيق ذلك أولاً من خلال توضيح تقنية التلقيح المهبلي في الفئران المعالجة بالإستروجين. بعد ذلك، وبعد قتل الفأر رحيماً، سيتم إجراء غسيل مهبلي لاستعادة المبيضات.

بعد ذلك، سيتم استئصال أنسجة المهبل و/أو العقد اللمفاوية المهبلية المصرفة. يمكن فحص سائل الغسيل مجهريًا لإظهار فطريات candida المرتبطة بالخلايا الظهارية المهبلية، أو زرعه على أغار لتقدير العبء الفطري المهبلي. كما يمكن استخدام مسحة من الجزء الخلوي لصبغ الخلايا الظهارية والخلايا اللمفاوية.

تتمثل الميزة الرئيسية لاستعراض هذه التقنية في تمكين مستخدمي النموذج الحيواني لالتهاب المهبل من تنفيذها بأقصى قدر من الكفاءة والفاعلية. وتجيب هذه التقنية على أسئلة جوهرية في مجال التهاب المهبل وعلم البيئة، مثل الاستجابات المناعية للمضيف، والتوزيع الخلوي، وفاعلية الأدوية، وفاعلية العلاج المناعي، بالإضافة إلى تأثيرات التحصين، وذلك من خلال استعراض التقنية. ستقوم اليوم طالبة الدراسات العليا في مختبري، Junco Yano، بإصابة فأر بـ C albicans بعد ثلاثة أيام من إعطاء حقنة من beta estradiol.

ابدأ بتثبيت الفأر على سطح gRED مستوٍ لتمكينه من التشبث. بعد ذلك، أمسك قاعدة الذيل بإصبعين وارفع الورك للأعلى بحيث تكون الفتحة المهبلية مواجهة إليك. أدخل طرف الماصة بعمق خمسة مليمترات تقريبًا في التجويف المهبلي، ثم اسحب ما يصل إلى 20 µL من معلق اللقاح.

أتمِ هذه الخطوة بأسرع ما يمكن وبكل رفق لتقليل توتر الفأر. بعد فترة الحضانة المطلوبة، قم بقتل الحيوان رحمةً وفقاً للبروتوكول المتبع في منشأتك. ثم، وباستخدام إصبعين، أمسك الفأر من قاعدة الذيل بحيث يكون موجهاً للأسفل لتصبح فتحة المهبل مكشوفة لاستخدام الماصة.

أدخل 100 µL من محلول PBS المعقم في التجويف المهبلي، وقم بإجراء عملية الغسيل عن طريق السحب والتحريك المتكرر. إذا انسدت طرف الماصة بالخلايا، قم بتفريغ الخلايا المسببة للانسداد وواصل عملية الغسيل بما تبقى من محلول PBS. اجمع سائل الغسيل في أنبوب طرد مركزي دقيق.

بعد الانتهاء من إجراء الغسيل المهبلي، ضع الفأر على ظهره وقم بتشبيع منطقة الأربية بـ 70%ethanol. وباستخدام ملقط، ارفع الفتحة البولية للأعلى بحيث تصبح فتحة المهبل مكشوفة. أدخل ملقطاً منحنياً في تجويف المهبل وحدد موقع عنق الرحم مع الحفاظ على إمساك محكم بواسطة الملقط.

استخرج عنق الرحم عبر التجويف المهبلي، واستأصل المهبل عند قاعدة فتحة المهبل، ثم افصل عنق الرحم عن المهبل باستخدام مقص جراحي. نظرًا لأن أنسجة المهبل تكون منكمشة، قم بقلبها للحفاظ على التوجيه الأصلي، أو افتحها على شكل ورقة عن طريق إجراء شق جانبي لاستئصال العقد اللمفاوية القطنية والحيوان في وضعية الاستلقاء على ظهره. قم بإشباع منطقة البطن بـ 70%ethanol.

قم بإجراء شق جانبي يبدأ من أسفل البطن وصولاً إلى الصدر، ثم قم بكشف الأعضاء الداخلية باستخدام ملقطين في كلتا اليدين. حرك الأمعاء إلى الأعلى حتى تصبح الأوعية الدموية المركزية مرئية. حدد موقع الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي البطني.

يمكن تحديد زوج من العقد اللمفاوية القطنية المجاورة للشريان الأورطي البطني، والتي تقع تقريبًا في منتصف المسافة بين منشأ الشرايين الكلوية والشرايين الحرقفية المشتركة. ويمكن تمييز هذه العقد اللمفاوية بصريًا عن الأنسجة الدهنية من خلال قوامها المرن، كما أنها تكون أفتح لونًا وأكثر عتامة مقارنة بالأنسجة الدهنية. كما أنها تكون أكبر حجمًا بشكل ملحوظ في الحيوانات المصابة مقارنة بتلك غير الملقحة.

يتم استئصال العقد الليمفاوية من الحيوانات عن طريق وضع ملاقط دقيقة تحت العقدة ثم سحبها بلطف لفصلها عن الأنسجة المحيطة. وبعد استئصال الأنسجة، تُنقل العقد الليمفاوية إلى شاشة سلكية معقمة موضوعة داخل طبق بتري زجاجي معقم يحتوي على حوالي 10 milliliters من محلول هانك الملح الموازن (Hank's balanced salt solution). لعزل الخلايا الليمفاوية، يُرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب.

تتكون الأجزاء الخلوية لسائل غسيل المهبل من الفئران التي تم تلقيحها قبل أربعة أيام على الأقل عادةً من خلايا ظهارية مصابة بالكانديدا ورشاحات خلوية، كما هو موضح هنا بواسطة المجهر للفحص المباشر. يمكن التعرف على الكانديدا من خلال وجود PHA بالإضافة إلى الخميرة. هنا يتم صبغ تحضيرات لطخات من سائل غسيل المهبل.

باستخدام تقنية لطاخة باب (pap smear) لفحص الخلايا الظهارية وكريات الدم البيضاء المتسللة والتي تعد الخلايا المتعادلة هي الخلايا الرئيسية فيها، ويمكن التعرف عليها من خلال الفصوص الثلاثية النواة. يُكشف عن عدد قليل جداً من الخلايا المتعادلة، إن وجدت، في الفئران غير الملقحة. يوضح هذا الشكل مثالاً على العبء الفطري المهبلي.

يتم جمع سائل الغسل المهبلي في نقاط زمنية محددة واستزراعه لتعداد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU). في هذا المثال، جُمع السائل في اليوم الخامس بعد التلقيح، ثم خُفف تسلسلياً، ووُزع على أطباق الاستزراع، وحُضن لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، يتم عد المستعمرات وحساب العبء الفطري المهبلي؛ حيث يستمر الاستعمار المهبلي أو العدوى بفطر candida لعدة أسابيع في الفئران الملقحة والمعالجة بالإستروجين.

بينما تفشل المبيضات (candida) في تكوين استعمار مهبلي في الفئران الملقحة غير المعالجة بالإستروجين، تظل الفئران غير الملقحة والمعالجة بالإستروجين سلبية للمبيضات طوال الفترة الزمنية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء الغسولات المهبلية إما لمرة واحدة على فئران منفصلة في كل نقطة زمنية، أو بشكل طولي في نفس الفئران تحت التخدير. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تثبيت الحيوانات بإحكام لتجنب إحداث صدمة للمهبل، ويرجى تخصيص الوقت اللازم للغسل بدقة للحصول على تقدير دقيق للعبء الفطري المهبلي عند استخراج الأنسجة المهبلية.

استخدم محلول PBS الساكن لمنع جفاف العينات، ويرجى توخي الحذر لعدم إتلاف الأوردة والشرايين الرئيسية عند استئصال العقد اللمفاوية، وأثناء معالجة خلايا العقد اللمفاوية، احتفظ بها على الثلج أو عند درجة حرارة 4 °C للحفاظ على حيوية الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توظيف نموذج الفأر التجريبي لالتهاب المهبل بفطر الكانديدا (candida vaginitis) لقياس الحمل الفطري المهبلي كمياً بشكل قابل للتكرار، واستئصال الأنسجة المهبلية أو اللمفاوية لإجراء فحوصات مناعية أو نسيجية محددة.