طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقليل تدهور الصور البيولوجية التي تسببها المساحات الهوائية في أوراق النبات للحصول على صور أوضح للخلايا الحية داخل الورقة. إذا تم تركيب الورقة في وسط تركيب مائي وتم إثارة الفلوروفور بواسطة الليزر ، فإن العديد من المساحات الهوائية غير المملوءة والتغيرات في معامل الانكسار داخل الأنسجة الموضحة باللون البرتقالي تحد من قوة الإشارة العميقة من داخل الأنسجة في الصورة الناتجة. إذا تم تركيب الورقة بدلا من ذلك في كل خط فلورو أو PFD ، فإن الإثارة بالليزر الناتجة للفلوروفور تكون أقل توهنا وتسمح بنقل أفضل للإشارات المنبعثة.

في النهاية ، يعطي استخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر مع وسيط تركيب PFD صورا واضحة للخلايا الحية داخل ورقة النبات على عمق يزيد عن ضعف العمق الممكن عند استخدام وسط تركيب مائي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التثبيت أو تركيب الأوراق والوسائط المائية ، هي أنها تقلل من الانكسار داخل الحشوة المتوسطة وتتيح تصويرا أكثر دقة للخلايا الحية العميقة داخل الورقة ، والتي تتجه إلى مشكلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علوم النبات ، مثل معالجة ملء الميزو ، وبيولوجيا الخلية ، والإشارات في الجسم الحي ، واستعمار الأوراق بواسطة مسببات الأمراض وتفاعلات ملء مسببات الأمراض ، على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا النبات الأساسية.

يمكن أيضا تطبيقه على الأنسجة الأخرى عالية الانكسار الغنية بالمجال الجوي مثل اللوالب البصيرة أو الرئة الفقارية. يوضح هذا الإجراء الدكتور جورج ليتلجون من مختبري إلى ماونت ليف. تبدأ العينات في PFD بإعداد شريحة مجهرية بحشية نفاذة للغاز من بولي ثنائي ميثيل سلون أو P-D-M-S-P-D-M-S عبارة عن بوليمر لزج مرن يمكن تشكيله لتوفير غرفة مصممة خصيصا للمتطلبات التجريبية.

قم بموازنة PFD بالهواء عن طريق هز كمية صغيرة من PFD في زجاجة مملوءة بالهواء. يمكن تحقيق ذلك أيضا عن طريق فقاعات الهواء من خلال PFD بعد ذلك ، صب PFD في طبق بتري مفتوح وتعويم شتلة كاملة أو ورقة استكمال على السائل لمدة خمس دقائق. يجب أن تصبح الأنسجة شفافة تذكرنا بالأنسجة المزججة.

قد تبدو الأوراق أغمق أو أفتح مما كانت عليه قبل التعرض لمرض PFD ، اعتمادا على ظروف الإضاءة وعمر الأنسجة المستخدمة. أخيرا ، املأ غرفة PDMS ب PFD المتساوي الهوائي وانقل عينات الأنسجة بعناية من طبق بتري الحضانة إلى غرفة PDMS. ختم الشريحة بغطاء وزلة وصورة.

وفقا للمتطلبات التجريبية ، تم تحضين أوراق الأشهر لمدة خمس دقائق في تعليق من البروتين الفلوري الأخضر المؤتلف أو GFP. في الفحص المجهري PFD لعينات الأوراق المحتضنة PFD يظهر أن غالبية المساحات الهوائية مغمورة ب GFP المؤتلف المعلق في PFD. GFP باللون الأخضر ، ويمثل اللون الأحمر الكلوروفيل ، وفلورة اللوتو وخلايا ملء الميز.

من الواضح أن الورقة تغمرها المياه عند الحضانة ب PFD ، ولكن قد تبقى جيوب الهواء العرضية لا يغمر الماء الورقة في ظل هذه الظروف. هنا ، يتم تحضين أوراق opsys التي تعبر عن كوكب الزهرة ، وهو نوع من YFP ، والذي يتم توطينه في العصارة الخلوية وتركيبها في الهواء أو الماء أو المسح بالليزر PFD. يظهر الفحص المجهري متحد البؤر للعينات ميزة PFD على الهواء والماء مع زيادة تقريبية بمقدار الضعف في عمق التصوير.

عند مقارنة PFD والماء بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس إلى 10 دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الغطاء المحيطي يذيب طلاء الأظافر والتفلون ، لكنه متوافق مع شحم السيليكون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام كل فلورو ديلين كوسيط تركيب لتحسين التصوير في خلايا أوراق النبات.

لا تنس أنه في حين أن كل فلورو delin غير سام ، فإننا نوصي باعتماد ممارسات السلامة القياسية عند تنفيذ هذا الإجراء.