طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقليل تدهور الصور البيولوجية الناتج عن الفراغات الهوائية في أوراق النباتات للحصول على صور أكثر وضوحاً للخلايا الحية داخل الورقة. إذا تم تثبيت الورقة في وسط تثبيت مائي وتم تحفيز الفلوروفور بواسطة الليزر، فإن العديد من الفراغات الهوائية غير المملوءة والتغيرات في معامل الانكسار داخل الأنسجة الموضحة باللون البرتقالي تحد من قوة الإشارة القادمة من عمق النسيج في الصورة الناتجة. أما إذا تم تثبيت الورقة بدلاً من ذلك في مادة per fluoro deline أو PFD، فإن تحفيز الليزر الناتج للفلوروفور يكون أقل تضعيفاً ويسمح بنقل أفضل للإشارات المنبعثة.

وفي نهاية المطاف، فإن استخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر مع وسط التثبيت PFD يمنح صوراً واضحة للخلايا الحية داخل ورقة النبات عند عمق يزيد عن ضعف العمق الممكن الوصول إليه عند استخدام وسط تثبيت مائي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تثبيت الأوراق أو استخدام الأوساط المائية، في أنها تقلل من الانكسار داخل النسيج المتوسط (mesophyll) وتتيح تصويراً أكثر دقة للخلايا الحية في أعماق أكبر داخل الورقة، وهو أمر كان يمثل تحدياً سابقاً. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في علم النبات، مثل دراسة بيولوجيا خلايا النسيج المتوسط وإشارات الخلايا في الجسم الحي (in vivo)، واستعمار الممرضات للأوراق والتفاعلات بين الممرض والنسيج المتوسط، مما يوفر رؤى معمقة حول البيولوجيا الأساسية للنبات.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنسجة أخرى عالية الانكسار وغنية بالمساحات الهوائية، مثل الحلزونات الداخلية أو رئات الفقاريات. سيقوم الدكتور George Littlejohn من مختبري To Mount Leaf بتوضيح هذا الإجراء. تبدأ عينات PFD بتجهيز شريحة مجهرية باستخدام حاشية نفاذة للغاز من مادة poly dimethyl siloxane أو P-D-M-S، وهي عبارة عن بوليمر لزج مرن يمكن تشكيله لتوفير غرفة مصممة وفقاً للمتطلبات التجريبية.

قم بموازنة الـ PFD مع الهواء عن طريق رج حجم صغير من الـ PFD في زجاجة مملوءة بالهواء. ويمكن تحقيق ذلك أيضًا عن طريق تمرير فقاعات الهواء عبر الـ PFD، بعد ذلك، صب الـ PFD في طبق بتري مفتوح وضع بادرة كاملة أو ورقة مقطوعة لتطفو على السائل لمدة خمس دقائق. يجب أن تصبح الأنسجة شفافة بشكل يشبه الأنسجة المزججة.

قد تبدو الأوراق أدكن أو أفتح لوناً مما كانت عليه قبل التعرض لـ PFD، وذلك اعتماداً على ظروف الإضاءة وعمر النسيج المستخدم. وأخيراً، املأ حجرة PDMS بـ PFD المُشبع بالهواء، وانقل عينات النسيج بعناية من طبق بتري الخاص بالتحضين إلى حجرة PDMS. قم بإغلاق الشريحة باستخدام غطاء شريحة ثم قم بالتصوير.

وفقاً للمتطلبات التجريبية، تم تحضين أوراق النبات لمدة خمس دقائق في معلق من البروتين الفلوري الأخضر المؤتلف أو GFP. وفي الفحص المجهري لعينات الأوراق المحضنة في PFD، يظهر أن غالبية المساحات الهوائية مغمورة ببروتين GFP المؤتلف المعلق في PFD. ويظهر GFP باللون الأخضر، بينما يمثل اللون الأحمر الكلوروفيل، والفلورة الذاتية، وخلايا النسيج المتوسط.

من الواضح أن الورقة تُغمر بالكامل عند الحضن باستخدام PFD، إلا أن بعض جيوب الهواء قد تظل موجودة أحياناً، بينما لا يغمر الماء الورقة في ظل هذه الظروف. هنا، يتم حضن وتثبيت أوراق opsys التي تعبر عن Venus، وهو أحد متغيرات YFP الذي يتوضع في العصارة الخلوية، في الهواء أو الماء أو PFD لإجراء المسح الليزري. ويظهر المجهر البؤري للعينات تفوق PFD على الهواء والماء، مع زيادة تقريبية بمقدار ضعفين في عمق التصوير.

عند مقارنة PFD بالماء، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس إلى 10 دقائق بمجرد إتقانها إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء إجراء هذه العملية، من المهم تذكر أن perflurodecalin يذيب طلاء الأظافر والتفلون، ولكنه يتوافق مع شحم السيليكون. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام perflurodecalin كوسيط تثبيت لتحسين التصوير في خلايا أوراق النباتات.

لا تنسَ أنه على الرغم من أن per fluoro delin غير سام، إلا أننا نوصي باتباع ممارسات السلامة القياسية عند تنفيذ هذا الإجراء.