طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي
January 16th, 2012
نحن تصف استخدام perfluorodecalin كوسيط الارتشاحي المتزايدة. هذه هي طريقة بسيطة لتحسين عمق في التصوير thaliana Arabidopsis أنسجة نبات مع الحد الأدنى من التأثير الفيزيولوجي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقليل تدهور الصور البيولوجية التي تسببها المساحات الهوائية في أوراق النبات للحصول على صور أوضح للخلايا الحية داخل الورقة. إذا تم تركيب الورقة في وسط تركيب مائي وتم إثارة الفلوروفور بواسطة الليزر ، فإن العديد من المساحات الهوائية غير المملوءة والتغيرات في معامل الانكسار داخل الأنسجة الموضحة باللون البرتقالي تحد من قوة الإشارة العميقة من داخل الأنسجة في الصورة الناتجة. إذا تم تركيب الورقة بدلا من ذلك في كل خط فلورو أو PFD ، فإن الإثارة بالليزر الناتجة للفلوروفور تكون أقل توهنا وتسمح بنقل أفضل للإشارات المنبعثة.
في النهاية ، يعطي استخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر مع وسيط تركيب PFD صورا واضحة للخلايا الحية داخل ورقة النبات على عمق يزيد عن ضعف العمق الممكن عند استخدام وسط تركيب مائي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التثبيت أو تركيب الأوراق والوسائط المائية ، هي أنها تقلل من الانكسار داخل الحشوة المتوسطة وتتيح تصويرا أكثر دقة للخلايا الحية العميقة داخل الورقة ، والتي تتجه إلى مشكلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علوم النبات ، مثل معالجة ملء الميزو ، وبيولوجيا الخلية ، والإشارات في الجسم الحي ، واستعمار الأوراق بواسطة مسببات الأمراض وتفاعلات ملء مسببات الأمراض ، على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا النبات الأساسية.
يمكن أيضا تطبيقه على الأنسجة الأخرى عالية الانكسار الغنية بالمجال الجوي مثل اللوالب البصيرة أو الرئة الفقارية. يوضح هذا الإجراء الدكتور جورج ليتلجون من مختبري إلى ماونت ليف. تبدأ العينات في PFD بإعداد شريحة مجهرية بحشية نفاذة للغاز من بولي ثنائي ميثيل سلون أو P-D-M-S-P-D-M-S عبارة عن بوليمر لزج مرن يمكن تشكيله لتوفير غرفة مصممة خصيصا للمتطلبات التجريبية.
قم بموازنة PFD بالهواء عن طريق هز كمية صغيرة من PFD في زجاجة مملوءة بالهواء. يمكن تحقيق ذلك أيضا عن طريق فقاعات الهواء من خلال PFD بعد ذلك ، صب PFD في طبق بتري مفتوح وتعويم شتلة كاملة أو ورقة استكمال على السائل لمدة خمس دقائق. يجب أن تصبح الأنسجة شفافة تذكرنا بالأنسجة المزججة.
قد تبدو الأوراق أغمق أو أفتح مما كانت عليه قبل التعرض لمرض PFD ، اعتمادا على ظروف الإضاءة وعمر الأنسجة المستخدمة. أخيرا ، املأ غرفة PDMS ب PFD المتساوي الهوائي وانقل عينات الأنسجة بعناية من طبق بتري الحضانة إلى غرفة PDMS. ختم الشريحة بغطاء وزلة وصورة.
وفقا للمتطلبات التجريبية ، تم تحضين أوراق الأشهر لمدة خمس دقائق في تعليق من البروتين الفلوري الأخضر المؤتلف أو GFP. في الفحص المجهري PFD لعينات الأوراق المحتضنة PFD يظهر أن غالبية المساحات الهوائية مغمورة ب GFP المؤتلف المعلق في PFD. GFP باللون الأخضر ، ويمثل اللون الأحمر الكلوروفيل ، وفلورة اللوتو وخلايا ملء الميز.
من الواضح أن الورقة تغمرها المياه عند الحضانة ب PFD ، ولكن قد تبقى جيوب الهواء العرضية لا يغمر الماء الورقة في ظل هذه الظروف. هنا ، يتم تحضين أوراق opsys التي تعبر عن كوكب الزهرة ، وهو نوع من YFP ، والذي يتم توطينه في العصارة الخلوية وتركيبها في الهواء أو الماء أو المسح بالليزر PFD. يظهر الفحص المجهري متحد البؤر للعينات ميزة PFD على الهواء والماء مع زيادة تقريبية بمقدار الضعف في عمق التصوير.
عند مقارنة PFD والماء بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس إلى 10 دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الغطاء المحيطي يذيب طلاء الأظافر والتفلون ، لكنه متوافق مع شحم السيليكون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام كل فلورو ديلين كوسيط تركيب لتحسين التصوير في خلايا أوراق النبات.
لا تنس أنه في حين أن كل فلورو delin غير سام ، فإننا نوصي باعتماد ممارسات السلامة القياسية عند تنفيذ هذا الإجراء.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة استخدام بيرفلوروديكالين كوسيط تثبيت نفاذ لتعزيز عمق التصوير في أنسجة أوراق نبات الأرابيدس. تقلل هذه الطريقة من التأثير الفسيولوجي بينما تحسن وضوح صور الخلايا الحية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا النبات
- تقنيات التصوير
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تتلف المسافات الهوائية في أوراق النبات الصور البيولوجية.
- تحدي وسائط التركيب المائية من قوة الإشارة في التصوير.
- بيرفلوروديكالين (PFD) يقلل من الانكسار ويحسن التصوير.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على الأنسجة عالية الانكسار الأخرى.
هدف الدراسة
- لتحسين عمق تصوير الخلايا الحية في أوراق النبات.
- لتوفير صور أوضح لدراسة بيولوجيا النبات.
- لتسهيل البحث في بيولوجيا الخلية وتفاعلات الممرضات.
الطرق المستخدمة
- تحضير غرفة PDMS قابلة للتنفس.
- تحقيق التعادل بين PFD والهواء.
- تحضين عينات الأوراق في PFD.
- التصوير بميكروسكوب المسح بالليزر المجسم.
النتائج الرئيسية
- يتيح PFD انتقالًا أفضل للإشارات المنبعثة.
- عمق التصوير أكثر من ضعف مقارنةً بالوسائط المائية.
- تمتلئ معظم المسافات الهوائية في الأوراق بـ PFD.
- يمكن إجراء التقنية بسرعة وفعالية.
الاستنتاجات
- بيرفلوروديكالين هو وسيط تثبيت فعال للتصوير.
- تعزز هذه الطريقة دراسة الخلايا الحية في النباتات.
- يجب اتباع إجراءات السلامة القياسية خلال العملية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution imaging of live plant tissues is often limited by refractive index mismatches and airspaces, which degrade signal quality and depth. The use of perfluorodecalin (PFD) as an infiltrative imaging medium enables deeper, clearer visualization of living cells without physiological compromise. This capability supports more predictive and reliable biological insights at early discovery and assay development stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular processes and signaling in intact, physiologically relevant plant tissues.
- Reduces optical artifacts, supporting more accurate functional target validation in complex biological matrices.
- Improves predictive confidence for downstream biological hypotheses by minimizing imaging-induced artifacts.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of live, optically accessible samples for quantitative imaging assays.
- Supports reproducible imaging conditions by minimizing refractive index mismatches and signal attenuation.
- Enables robust evaluation of fluorescent reporters and cellular markers in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Applicable to other airspace-rich tissues, supporting translational continuity in plant and potentially animal models.
- Provides mechanistic de-risking by allowing in vivo-like imaging conditions for preclinical studies.
- Improves alignment between discovery imaging outputs and preclinical model requirements.
Pipeline & Workflow Integration
PFD-based imaging integrates at the interface of early discovery and assay development, enabling high-fidelity visualization from hypothesis testing through preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies by enabling deep, artifact-minimized imaging of live tissues.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of experimental conditions.
- Analytics: Enhances measurement reliability by reducing signal loss and optical distortion at depth.
- Translational Research: Bridges imaging methodologies between plant and animal systems where airspace is a confounding factor.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable imaging enhancement for diverse biological models requiring deep tissue visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in live tissue imaging.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and improves reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions by providing higher quality biological data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing technical imaging barriers in complex tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and handling of perfluorocarbon media.
- Needs compatible imaging chambers and materials, as PFD dissolves some plastics and varnishes.
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and sample preparation.
- Adaptable to various airspace-rich tissues beyond Arabidopsis leaves, with attention to tissue-specific requirements.
- Practical limitations include occasional residual air pockets and material compatibility constraints.
