الكمية مقارنة رابطة الدول المستقلة التنظيم العنصر (لجنة المساواة العرقية) في الأنشطة المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة السوداء البطن

الهدف العام من هذا الإجراء هو القياس الكمي للأنشطة التنظيمية الجينية للعناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة أو CRE النشطة أثناء ذبابة الفاكهة ميلان التطور المتحول المعدي. ابدأ بطرق التكامل الخاصة بالموقع لإنشاء خطوط من CREs المدمجة عبر الجينات كجينات معدلة وراثيا. باستخدام مجهر ستيريو ، احصل على عينات معدلة وراثيا لمرحلة النمو الصحيحة.

قم بإزالة العينات من الحانة الخارجية وقم بتثبيتها على مجهر زجاجي. انتقل إلى تسجيل مستوى ونمط تعبير بروتين مراسل الفلورسنت في عينات التثبيت الكاملة عن طريق التحليل المجهري متحد البؤر. أخيرا ، حدد مستوى تعبير بروتين مراسل الفلورسنت للصور متحدة البؤر المسجلة باستخدام أداة برنامج Image J.

تحدد هذه النتائج مستوى من النشاط التنظيمي الجيني لمساعدة العنصر التنظيمي وتسهيل المزيد من دراسات التعبير الجيني المقارنة على إصدارات CRE المعدلة. يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على الأسئلة الرئيسية ويشعر بالاهتمام بتنظيم الجينات وكيفية ترميز هذا التنظيم الجيني. يبدو الحمض النووي وكأنه بيولوجيا تنموية وتطورية.

تم تطوير هذا الإجراء لتقديم رؤى حول العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة التي تعمل أثناء ذبابة الفاكهة ميلانوجاستر التطور المتحول. ومع ذلك ، من حيث المبدأ ، يمكن تطبيقه على العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة التي تعمل خلال مراحل النمو الأخرى وأنواع ذبابة الفاكهة الأخرى ، أو حتى الكائنات الحية النموذجية الأخرى. من أجل توسيع الخطوط المعدلة وراثيا ، قم بإعداد قارورتين مع العديد من الذباب من الذكور والإناث في أيام متناوبة.

انقل الذباب من إحدى القوارير إلى قارورة جديدة. كرر هذا لمدة أسبوع. بحلول نهاية أسبوعين ، تحقق من أن ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا يتراوح من اليرقات إلى مراحل نمو البالغين.

ابدأ في وضع العينات في نهاية مرحلة اليرقات الثالثة عند تكوين غرفة الطوارئ. لاحظ أن العينة غير متنقلة. يتم تخفيف ER باللون الأبيض وقد تم تجنب الكرويات تحديد هذه النقطة الزمنية.

كصفر HAPF. تميز الذكور عن الإناث بوجود غدد تناسلية ثنائية بالقرب من منتصف الجسم والتي تظهر على شكل دوائر شفافة للتدريج بناء على طول التحول. عند صفر HAPF ، انقل العينات إلى قارورة جديدة باستخدام فرشاة رسم مبللة.

أضف قطعة من منديل كيم ورطب بالماء لمنع العينات من الجفاف. الآن ، احتضان القارورة عند 25 درجة مئوية حتى HAPF المطلوب. بدلا من ذلك ، مراحل العينات عن طريق الفرز بناء على تحديد وجود وموقع العديد من العلامات المورفولوجية كما هو مفصل في النص المصاحب.

باستخدام شريط المختبر ، قم بلصق قطعة من شريط التعبئة على لوحة تشريح بحيث يكون سطح الشريط اللاصق متجها لأعلى. بلل فرشاة الطلاء وقم بتطبيق الرطوبة على العينات باستخدام فرشاة الطلاء. نقل العينات إلى مسحة كيم.

انقل العينات إلى شريط التعبئة والتمسك بالسطح الظهري متجها لأعلى. اترك العينات تجف لمدة 15 دقيقة. افتح غرفة الطوارئ تدريجيا باستخدام الملقط.

ابدأ من الأمام أو التجاعيد والمضي قدما نحو النهاية الخلفية. ثم انقل pui إلى قطرة من الزيت اللزج على شريحة مجهرية وقم بتقييم العينة مجهريا لعينات التثبيت الكاملة. استخدم إما الفوركس أو هدف 10 × لتركيز العينة.

باستخدام برنامج المجهر متحد البؤر ، اضبط الطول الموجي للإثارة للبروتين الفلوري المطلوب لمنع التبييض الضوئي. ابدأ بكثافة ليزر من خمسة إلى 10٪ إذا كانت الإشارة مخيبة للآمال ، فقم بزيادة الشدة حسب الحاجة من أجل تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. بالنسبة للصور متحدة البؤر ، قم بتمكين إعدادات البرنامج التي تعمل بمتوسط قياسات البكسل من عمليات المسح المكررة مثل حساب المتوسط kalman للمقارنات الكمية لنشاط CRE يستخدم القسم C حيث يبدو التألق أكثر كثافة.

قم بالتبديل إلى جدول البحث عن تحذير التشبع واضبط كسب جهد القناة والإزاحة إلى الإعدادات التي تكون فيها وحدات بكسل قليلة مشبعة. إذا لزم الأمر، اضبط فتحة العدسة متحد البؤر. بمجرد تحديد الإعدادات المثلى، قم بتشغيل مسح ZS للحصول على سلسلة من الصور على طول المحور Z.

عند اكتمال المسح الضوئي ، قم بتحويل مكدس الصور إلى إسقاط واحفظ ملف الصورة هذا بتنسيق TIF. للمقارنة الكمية لأنشطة CRE ، استخدم نفس الإعدادات متحدة البؤر لجميع العينات المكررة وخطوط الجينات المعدلة والمراسل. بالنسبة للتجربة مع برنامج Image J الذي بدأ ، افتح صورة TIFF ليتم تقييمها.

انقر فوق زر التحديد اليدوي وحدد مساحة العينة حيث المطلوب الكمية. للحصول على إحصائية قيمة البكسل ، انقر فوق علامة التبويب تحليل ثم حدد قياس. سجل متوسط درجة قيمة البكسل من مربع النتائج.

قم أيضا بتجميع متوسط قيمة بكسل ثانية من منطقة خلفية حيث لا يكون CRE نشطا. لاشتقاق متوسط قيمة بكسل معدلة، استمر في إنشاء إحصائيات قيمة البكسل للعينات النسخ المتماثل. ثم من النسخة المتماثلة من قيم البكسل المتوسطة المعدلة ، حدد متوسط النشاط التنظيمي ل CRE وقم أيضا بحساب الخطأ المعياري للمتوسط.

تستخدم هذه التجربة شدة النمط الظاهري لعين الإنقاذ البيضاء لجعل الخطوط المعدلة وراثيا متماثلة اللواقح. يتم استخدام خلفية وراثية متحولة للجين الأبيض مع تسلسل موقع هبوط TTP لتكامل الجينات المعدلة وراثيا الخاصة بالموقع. يتميز الأفراد المعدلين وراثيا ، نصفي ومتماثل اللواقح للناقل المتكامل بكثافة النمط الظاهري للون العين الذي تم إنقاذه بعدد نسخ الجين الأبيض المصغر المتكامل.

ثم يتم إنشاء الخطوط متماثلة اللواقح عن طريق عبور الذباب من الذكور والإناث مع أغمق نمط ظاهري للون العين. تستخدم العلامات المورفولوجية لتحديد مرحلة التحول لذبابة الفاكهة أثناء التحول من اليرقة إلى ذبابة الفاكهة البالغة. تنتقل العينة من خلال سلسلة من الأشكال النمطية التي يمكن استخدامها لتحديد الجنس وتقريب مرحلة النمو. هنا.

نسخة من النوع البري من A CRE يشار إليها باسم العنصر ثنائي الشكل تدفع مستويات عالية من تعبير مراسل EGFP في الجزء البطني ASIC من أنثى بوي. تم العثور على تسلسل 13 زوجا أساسيا داخل CRE هذا ليكون موقعا ملزما لعامل نسخ DSX ويتم توضيح الأهمية في الجسم الحي لهذا التسلسل من خلال تحديد النشاط التنظيمي ل CRE عندما يتم تحور موقع الربط هذا. تشير التحليلات الكمية إلى أن طفرة موقع DSX هذا قللت من النشاط التنظيمي إلى 28 زائد أو ناقص 3٪ من تعبير النوع البري في سياق موقع إدخال الجينات المعدلة وراثيا المستخدم هنا.

مقارنات مماثلة بتقييم الأنشطة التنظيمية لأليلات CRE داخل محددة أو بين CREs ذاتية المنشأ من أنواع منفصلة ، على سبيل المثال ، مقارنة بمستويات EGFP في الجزء الإناثي. ستة مدفوعة بسلالة Canin S ذاتية المعدة D Melin للأنواع D المنشطات و D willi تمتلك أنشطة تنظيمية تساوي 75 زائد أو ناقص 4٪ وصفر زائد أو ناقص 0٪ على التوالي. يمكن استخدام طرق الإجراء التالية مثل تداخل الحمض النووي الريبي مع جينات عامل النسخ للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية تفاعل جينات عامل النسخ هذه مع العناصر التنظيمية ل CYS.

يمكن الإشارة إلى ذلك من خلال زيادة ونقصان تعبير بروتين مراسل الفلورسنت الذي تحركه العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة بعد تطويره. مهد هذا الإجراء الطريق للباحثين في مجال تنظيم الجينات لاستكشاف الأهمية الوظيفية التي تتمتع بها أشكال العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة والطفرات المتطورة على التعبير الجيني.