Name: رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: اكتشف مراقبة نشاط الكيناز والفوسفاتيز خلال دورة الخلية باستخدام تقنية FRET في خلايا U2 OS. توفر هذه الطريقة رؤية مباشرة لتغيرات الفسفرة في الوقت الفعلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يتم اعتماد الكتاب من قبل مجلس الأبحاث السويدي ، ومؤسسة البحوث الاستراتيجية السويدية والمجتمع السويدي السرطان ، وسرطان الأطفال المجتمع السويدي ، آك Wibergs الأساس والأساس Jeanssons.

1. تقديم لجنة التحقيق إلى الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في transfect الخلايا مع التحقيق الذي تجريه الحنق على أساس المقاومة ومنح البلازميد. اختيار طريقة ترنسفكأيشن تتسم بالكفاءة في نوع الخلايا اهتمامك. U2OS للخلايا ، ومعيار أساليب ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يعطي نتائج كافية 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخلايا الموجودة في المضادات الحيوية المناسبة لسبعة أيام على الأقل. هذا يثري كمية من الخلايا معربا عن التحقيق ويحد من كمية الخلايا التي تحتوي على مستويات التعبير السامة ، أو مستويات التعبير التي تؤثر بشدة على دورة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) حدد لاستنساخ مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام خلايا ثابتة أو حي ، تحقق من أن كلا CFP وYFP موجودة في جميع الخلايا في النسبة تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة احتواء بعض الخلايا فقط أو CFP YFP ، حدث تأشب احتمالا. يمكن أن يحدث إما أثناء إعادة التركيب نمو البكتيريا أو بعد ترنسفكأيشن لجنة التحقيق ، وربما في الحالة الأخيرة تعتمد على نوعية البلازميد. كرر ع البلازميدالجبر ويصبح خطي من قبل البلازميد ترنسفكأيشن إذا استمرت المشكلة. </li></ol> 2. ratiometric رصد الحنق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور على أطباق أسفل الزجاج ، أو زلات لتركيب الغطاء في الغرفة. تأكد من أن أطباق / زلات تغطية توجد 1.5 (170 ميكرون سميكة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الخلايا في النمو دون الحمراء المتوسطة الفينول على مجهر epifluorescence بمحركات مع مجموعة التحكم في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ضمان تنظيم درجة الحموضة وسائل الإعلام ، إما عن طريق CO 2 أو باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة مثل يبوويتز - 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على الخلايا باستخدام الضوء المرسل. لا تبدو على الخلايا باستخدام ضوء الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ من خلال الحصول على صورة 12 بت أو 16 باستخدام الإثارة YFP (YFPex) ومرشحات YFP الانبعاثات (YFPem) ومرآة مناسبة مزدوج اللون. استخدام binning القصوى المتاحة التي لا يزال يسمح القرار المطلوب التحت خلوية. باستخدام binning عالية لتقليل مدة التعرض أو شدة أمر حاسم لتجنب الضيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أناasure أو تقدير شدة الضوضاء الخلفية وتقريبية من خلال قياس أو تقدير متوسط ​​، والحد الأدنى الخام والقيم بكسل كحد أقصى في منطقة خالية من الخلايا. تغيير وقت التعرض ومحايدة مرشحات الكثافة بحيث إشارة المتوسط ​​في الخلية هو ما يقرب من كثافة الخلفية بالإضافة إلى خمسة إلى عشرة أضعاف الفرق بين الحد الأقصى وشدة الخلفية دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أن الصور ليست على وشك المشبعة. ينبغي للكثافة القصوى في صورة أقل من نصف النطاق الديناميكي (مثل ماكس 2000 في صورة 12 بت) للسماح لشدة الخلافات عندما تدخل خلايا الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2،4-2،6 باستخدام الإثارة وعوامل الانبعاثات CFP YFP ومرآة مناسبة مزدوج اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مناطق متعددة مع خلايا transfected ، باستثناء المناطق المستخدمة ل2،4-2،7 نقطة ، وضمان أقصى قدر من كثافة أقل من نصف النطاق الديناميكي في جميع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تجربة مرور الزمن اكتساب صورتين كل 45 دقائق باستخدام YFPex -- YFPem وCFPex -- YFPem مجموعات التصفية. </li></ol> 3. وتحسين شروط التحقق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور التي اكتسبوها ورصد زمن دورة الخلية من الانقسام على الانقسام للخلايا التي تعبر عن لجنة التحقيق transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن دورة الخلية قياس الوقت لنشر البيانات لنوع من الخلايا المستخدمة. بدلا من ذلك ، untransfected الفيلم من خلال الحصول على خلايا صورة واحدة من الضوء ينتقل فقط (على سبيل المثال مدينة دبي للإنترنت ، أو مرحلة التباين) في كل ساعة للحصول على أوقات إشارة دورة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة الوقت من الانقسام الخيطي ليتوافق مع مواعيد مرجعية دورة الخلية ، انتقل إلى الخطوة 4. بدلا من ذلك ، وإعادة الحصول على صور باستخدام الصعب التعرض لمزيد من الوقت أو عدة نقاط ض المستويات وكرر الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfected الفيلم في حالة من الانقسام في وقت لالانقسام لا تتوافق مع إشارة توقيت دورة الخلية ، من خلال الحصول على خلايا صورة واحدة من الضوء ينتقل فقط (على سبيل المثال مدينة دبي للإنترنت ، أو مرحلة النقيض) كل ساعة تليها صورة واحدة في نهايةالتجربة لتحديد الخلايا transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الخلايا لا تزال تظهر transfected مرات أطول دورة الخلية ، كرر الخطوة 1 ولكن أقل transfect التحقيق أو تحديد لاستنساخ المستقرة التي تحتوي على كميات منخفضة جدا من التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الخلايا طبيعية تظهر transfected مرات دورة الخلية في غياب ضوء الفلورسنت ، وكرر الخطوة 2 ولكن أقل من التعرض عن طريق تعديل binning ، مرشحات الكثافة محايدة ، ومدة التعرض ، والوقت بين الصور. </li></ol> 4. تحليل الحنق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إجراء التحليل من قبل معظم البرامج المخصصة لالمجهري. هنا ونحن تصف كيفية إجراء التحليل باستخدام ImageJ مجانية ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> ) الاستفادة من البرنامج المساعد زائد نسبة ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . HTML</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور في ImageJ. في حالة الصور في شكل لSTAC متعدد الألوانك (على سبيل المثال Deltavision) ، فصل عن طريق تحويل القنوات الفردية الأولى هم لhyperstack : صورة لhyperstack - hyperstack المكدس والانقسام في وقت لاحق لهم باستخدام مداخن قناة واحدة : صورة - hyperstack - تقليل أبعاد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضاعفة YFPex -- مكدس YFPem به مع 3 : عملية - الرياضيات ضرب هذه الخطوة اختيارية ، والغرض منه هو زيادة وضوح بصرية للصور عن طريق ضمان أن النسب ليست في نطاق بين 0 و 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في YFPex -- مكدس YFPem ، رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في المنطقة التي تخلو من الخلايا ، ولكن هذا هو على مقربة من خلية إلى أن يقاس. قد خلايا مختلفة في نفس الصورة تتطلب مختلف المناطق ، لأن كلا من الخلفية وكثافة الإشارة عادة في مركز أقوى من الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى مدير ROI العائد على الاستثمار : تحليل عائد الاستثمار ، الأدوات ، مدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة متوسط ​​العائد على الاستثمار في YFPex على حد سواء -- وYFPem CFPex و-- مكدس YFPem : تحليل القياس </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار في timepoints متعددة والتحقق من أن شدة الخلفية بالقرب من الخلية التي تهم مماثلة طوال الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط القياسات لتشمل الحد الأدنى من شدة : تحليل لضبط قياسات مين وماكس قيمة الرمادي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة التي تغطي معظم الاهتمام من خلية وقياس كثافة أدنى في YFPex على حد سواء -- وYFPem CFPex و-- YFPem المكدس. تأخذ الفرق بين الحد الأدنى من قياس كثافة وشدة الخلفية من 4.6 وتقسيمها على اثنين. يوفر هذا تقدير لقيمة بدءا قطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح نسبة زائد. حدد YFPex -- YFPem وCFPex و-- YFPem المكدس. لنسبة الحنق ، حدد CFPex -- YFPem كما المكدس 1 ، لمقلوب نسبة الحنق تصور تحقيقات حيث يقلل كفاءة الحنق على الفسفرة ، حدد YFPex -- YFPem كما مكدس 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج قياس كثافة الخلفية والقيم لقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين التحجيم من المكدس نسبة الناتج وتطبيق ش تبدو مناسبةع الجدول (طرفية) لتصور التغييرات النسبة. </li></ol> 5. ممثل النتائج Plk1 النشاط مرئية الأول في النواة في المرحلة G2 والقمم خلال الانقسام. الشكل 3 يوضح تجربة باستخدام إعدادات الضيائية الحد الأدنى كما هو موضح في القسم 2. يرجى ملاحظة أن هذا هو نتيجة ممثل الأولية والتي يمكن تعديلها أو ظروف التعرض الوقت بين الصور لزيادة اشارة الى نسبة الضوضاء أو قرار مؤقت. يوضح الشكل 3D أن غالبية الخلايا تتكاثر معربا عن التحقيق مع خلية دورة الزمن ما بين 20 و 25 ساعة ، مشيرا الى ان ظروف التصوير ومستويات التعبير عن التحقيق لا تؤثر على توقيت دورة الخلية. وإن كان هناك ضجيج كبير ، والاتجاه نحو زيادة النشاط في Plk1 G2 وتبلغ ذروتها في 14 الانقسام مرئيا بوضوح (الشكل 3A). معالجة البيانات الخام ، والتي تعني هنا الترشيح المقدمة بوصفها kymograph (الشكل 3B) ، أو في تقدير حجم را مقلوب المتوسط يمكن تيو (الشكل 3C) تعزيز الوضوح. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. مبدأ تحقيق الحنق القائم على رصد أنشطة كيناز والفوسفاتيز. ترتبط اثنين fluorophores ، CFP عادة (الأزرق) وYFP (الأخضر) ، من خلال مجال الفوسفات وملزمة (البرتقال) وتسلسل phosphorylatable (الصفراء). الفسفرة (الحمراء) يتوسط ملزمة إلى المجال الفوسفات وملزمة ، وبالتالي إحداث تغيير متعلق بتكوين جزئي في التحقيق. نتائج تغيير متعلق بتكوين جزئي في الفرق في المسافة أو التوجه fluorophores بين البلدين ، الأمر الذي يؤثر على كفاءة بين الحنق وYFP CFP. ويمكن تصور أن يكون الحنق التي CFP مثيرة ورصد الانبعاثات YFP (الخطوط المنقطة). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. مخطط تخطيطي لإجراء التجارب. p_upload/3410/3410fig3.jpg "/&gt; الشكل 3. Plk1 النشاط مرئية الأول في النواة في المرحلة G2 والقمم خلال الانقسام. وتم تصوير الخلايا U2OS تعبر عن رصد المسبار الحنق المستندة Plk1 النشاط لمدة 60 ساعة 9،14 باستخدام نظام التصوير Deltavision Spectris مجهزة الهدف NA 20X الهواء 0.7 و مصباح الزئبق. وقد تم اختيار ظروف التصوير لسبب الضيائية الحد الأدنى ، كما هو مبين في المادة 2 ، وذلك باستخدام مرشحات binning 4x والكثافة المحايدة التي تمنع 99 ٪ من ضوء واردة. A ، تمثيل الألوان الزائفة مقلوب نسبة - الحنق ، بعد خلية واحدة إلى 4 الانقسامات. B ، kymograph من الخلية هو مبين في وبعد تطبيق مرشح الوسط. C ، القياس الكمي لمقلوب نسبة الحنق من الخلية هو موضح في D A. ، التراكمي دخول الإنقسامية من 50 الحنق التحقيق خلايا الإعراب ، بما في ذلك انقسامات الخلايا الوليدة.

<ol><li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+microscopy+in+2010%3A+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li>
<li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li>
<li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B%2FAkt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li>
<li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li>
<li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li>
<li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li>
<li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li>
<li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li>
<li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 Forthcoming.</li>
<li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorgan%2C+DO+%22The+cell+cycle+%3A+principles+of+control%22">The cell cycle : principles of control</a>. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).</li>
<li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+decision+to+enter+mitosis%3A+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li>
<li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li>
<li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+free%2C+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li>
</ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

رصد الحنق في جميع مراحل دورة الخلية تتطلب الاعتبارات التي هي أقل أهمية عند تقييم الاستجابات قصيرة الأجل للمؤثرات الخارجية. الأولى ، يتم بسهولة تقدم دورة الخلية مضطرب من جراء إشارات الإجهاد ، والتي تتطلب أن يتم الاحتفاظ الضيائية إلى الحد الأدنى. ثانيا ، يمكن لجميع الصحفيين تؤثر على العمليات الخلوية التي المعايرة من كاينيسات ، phosphatases أو مجالات التفاعل. ربما الطريقة الأكثر مباشرة لتقييم ما إذا كانت ظروف تجريبية كافية لقياس طول دورة الخلية من الانقسام إلى الانقسام وذلك لمقارنة ا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> كتالوج رقم </td><td> شركة </td></tr><tr><td> يبوفيتش L - 15 ، أي أحمر الفينول </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax - I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة </td></tr><tr><td> الجنين مصل البقر (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0.05 ٪ التربسين EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة </td></tr><tr><td> بوروميسين </td><td> P8833 </td><td> سيغما الدريخ </td></tr></tbody></table>

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي ratiometric الحنق

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) على أساس السماح للصحفيين 1 تقييم كيناز الذاتية والأنشطة الفوسفاتيز في الخلايا الحية. وعادة ما تتألف مثل هذه التحقيقات من المتغيرات من CFP وYFP ، تدخلت تسلسل phosphorylatable مجال الفوسفات وملزم. على الفسفرة ، والتشكل التغييرات التحقيق ، مما يؤدي الى تغيير في المسافة أو الميل بين CFP وYFP ، مما يؤدي إلى تغيير في كفاءة الحنق (الشكل 1). وقد نشرت تحقيقات عدة خلال العقد الماضي ، ورصد تحركات التوازن نشاط متعددة وphosphatases ، بما في ذلك مراسلي PKA 2 ، 3 PKB ، PKC 4 ، 5 PKD ، إرك 6 ، 7 JNK ، CDK 18 ، أورورا B 9 و 9 Plk1 . نظرا لتصميم وحدات ، تحقيقات إضافية من المرجح أن تظهر في 10 في المستقبل القريب. يتأثر تطور خلال دورة الخلية signali الإجهاد11 نانوغرام المسارات. على وجه الخصوص ، وينظم دورة الخلية بشكل مختلف خلال رابط الجأش النمو بالمقارنة مع الخلايا عندما يتماثلون للشفاء من الإجهاد 12. الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا من خلال دورة الخلية لذا يتطلب الحذر خاصة. هذا يصبح مشكلة خاصة عندما توظف ratiometric التصوير ، لأن المطلوب صورتين مع اشارة الى ارتفاع نسبة الضوضاء إلى تفسير صحيح للنتائج. Ratiometric الحنق وقد تم التصوير في الغالب من التغيرات في دورة الخلية تعتمد أنشطة كيناز والفوسفاتيز يقتصر على أقسام فرعية للدورة الخلية 8،9،13،14. هنا ، نحن نناقش طريقة لرصد الحنق على أساس تحقيقات باستخدام التصوير ratiometric طوال دورة الخلية البشرية. أسلوب يعتمد على المعدات التي تتوفر لكثير من الباحثين في علوم الحياة و لا يتطلب معرفة متخصصة المجهري أو معالجة الصور.

يتزايد استخدام الحنق المستندة للصحفيين لرصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة في الخلايا الحية. نحن هنا وصف الأسلوب على كيفية استخدام الحنق المستندة للصحفيين لتقييم دورة الخلية التي تعتمد على التغيرات في الفسفرة الهدف.

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

تسمح المراسلات القائمة على نقل طاقة الرنين لفورستر (FRET)1 بتقييم أنشطة الكيناز والفوسفاتاز الداخلية في الخلايا الحية. مثل هذه...

في هذا الفيديو، يتم رصد أنشطة الكيناز والفوسفاتاز طوال الدورة الخلوية باستخدام نقل طاقة الرنين لفورستر أو fret. هنا، يحتوي مسبار نشاط الكيناز الشبيه بـ polo 1 أو LK one على بروتين فلوري سماوي CFP في أحد طرفيه وبروتين فلوري أصفر YFP في الطرف الآخر. يتم نقل هذا المسبار بالتر transfection إلى خلايا U2 OS.بعد ذلك، ومن أجل فحص حالة فسفرة أهداف LK one خلال الانتقال من طور G2 إلى طور M، تخضع خلايا U2 OS التي تم إجراء عملية التعداء (transfected) لها إلى تصوير فلوري بفاصل زمني. عندما يكون CFP وYFP في تقارب وثيق ويتم استثارة CFP، تنتقل الطاقة إلى YFP ويمكن حينئذٍ اكتشاف انبعاث YFP. ومع ذلك، عندما يتم فسفرة المسبار، يؤدي التغير التشكيلي في البروتين إلى فصل CFP عن YFP.الآن عند استثارة CFP، يتم الكشف عن انبعاث قوي لـ CFP وانبعاث ضعيف فقط لـ YFP؛ ويظهر قياس نسبة انبعاث YFP بعد استثارة كل من CFP وYFP أن نشاط PLK one يزداد في مرحلة G two ويصل إلى ذروته أثناء الانقسام الفتيلى. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التصوير الهندسي القياسي، هي التركيز بشكل خاص على عدم اضطراب الدورة الخلوية سواء بسبب ظروف التصوير أو بسبب التعبير عن المسبار. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الدورة الخلوية، مثل مكان وزمان تنشيط كينازات أو فوسفاتازات محددة.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول الإنزيمات التي تنظم الدورة الخلوية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى تتطلب ظروفاً غير مفرزة، مثل مقايسات تكاثر الخلايا. ولمراقبة الدورة الخلوية البشرية، يتم ترانسفكشن خلايا U2 OS بمسبار نشاط PK one يعتمد على تقنية FRET. وباستخدام طريقة ترانسفكشن قياسية بفوسفات الكالسيوم، يتم اختيار الخلايا في pur mycin لمدة سبعة أيام على الأقل.يعمل هذا الإجراء على إثراء مجموعة الخلايا التي تعبر عن المسبار، ويحد من عدد الخلايا ذات مستويات التعبير السامة أو مستويات التعبير التي تؤثر بشدة على الدورة الخلوية. بعد ذلك، يتم اختيار المستعمرات المستقرة عن طريق التخفيف المحدود، ويُفحص التعبير عن CFP وYFP للتأكد من وجودهما في جميع الخلايا وبنفس النسبة تقريباً. وإذا كانت بعض الخلايا تحتوي على CFP أو YFP فقط، فمن المرجح أن يكون قد حدثت عملية إعادة تركيب؛ وفي هذه الحالة، كرر تحضير البلازميد باستخدام بكتيريا أقل عرضة لإعادة التركيب المتماثل، مثل خلايا sure 2، ثم قم بخصخصة البلازميد (linearize) وأعد عملية عفن الخلايا (transfection).بمجرد أن تعبر الخلايا عن المسبار بشكل مستقر، يتم استزراعها في أطباق ذات قاع زجاجي برقم 1.5 بعد أن تلتصق وتصل نسبة تلاقيها إلى 30 إلى 50%. استبدل الوسط بوسط مستقل عن CO2 ولا يحتوي على الفينول الأحمر، ثم ثبت الخلايا على مجهر فلوريسنس فوقي (epi fluorescence microscope) بمحرك مع ضبط التحكم في درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. يجب أن يكون المجهر مجهزاً بمرشحات إثارة وانبعاث لبروتيني CFP وYFP.مرآة ROIC مناسبة لمراقبة CFP و YFP وعدسة شيئية مناسبة للدقة المطلوبة. في هذه الحالة، تم استخدام عدسة شيئية هوائية 20 x NA 0.75. باستخدام الضوء النافذ، يتم ضبط تركيز الخلايا.تجنب استخدام الضوء الفلوري في هذه المرحلة لأن ذلك سيحفز استجابة إجهاد قد تؤدي إلى اضطراب في الدورة الخلية. ولتجنب السمية الضوئية، اضبط درجة الانحناء على أقصى قيمة متاحة تسمح بالدقة المطلوبة على المستوى دون الخلوي. بالنسبة لهذه التجربة، يجب أن يكون من الممكن التمييز بين النواة والسيتوبلازم.اضبط زمن تعريض قصيراً وأدخل مرشح كثافة محايدة عالية. بعد ذلك، قم بالتقاط صورة اختبار بدقة 12 أو 16 بت باستخدام استثارة وانبعاث YFP، ثم اضبط زمن التعريض ومرشحات الكثافة المحايدة بحيث تكون متوسط الكثافة في الخلية مساوياً تقريباً لكثافة الخلفية مضافاً إليها خمسة أضعاف الفرق بين أدنى وأقصى كثافة للخلفية. وللتحقق من عدم وصول الصور إلى مرحلة التشبع، افحص كثافة الفلورة لصورة العينة.يجب أن تكون الشدة القصوى في الصورة أقل من نصف النطاق الديناميكي للسماح بوجود اختلافات في الشدة عندما تدخل الخلايا في مرحلة الانقسام الفتيلي. بعد ذلك، كرر هذه العملية باستخدام مرشحات إثارة CFP ومرشحات انبعاث YFP. حدد مناطق متعددة تحتوي على خلايا محولة جينياً، مع استبعاد المناطق التي استُخدمت لضبط التركيز وتحسين ظروف التعريض الضوئي.بما أن هذه الإجراءات قد تكون أدت إلى استجابة إجهاد، تأكد من أن الكثافة القصوى أقل من نصف النطاق الديناميكي في جميع الخلايا. قم بتوجيه البرنامج لالتقاط صورتين كل 45 دقيقة باستخدام استثارة YFP، وانبعاث YFP واستثارة CFP. مرشحات انبعاث YFP.قم أيضاً بضبط الطول الإجمالي للتجربة ليتجاوز مدة الدورة الخلوية. بمجرد ضبط كل شيء، ابدأ في التقاط الصور، وبعد اكتمال عملية الالتقاط، افتح الصور المكتسبة وراقب وقت الدورة الخلوية من الانقسام الفتيل إلى الانقسام الفتيل التالي. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن المسبار المنقول هنا، كان وقت الدورة الخلوية يتراوح تقريباً بين 20 إلى 25 ساعة.قارن هذه النتائج بالبيانات الضابطة لنوع الخلايا المستخدم. إذا كان وقت الدورة الخلوية يتوافق مع التوقيتات المرجعية، يمكن تحليل الـ fret. وبمجرد التحقق من التوقيت، يمكن تحليل الصور.يمكن إجراء التحليل بواسطة معظم البرامج المخصصة للمجهرية. وفي هذه التجربة، تم استخدام البرنامج المجاني Image J مع إضافة ratio plus. ابدأ التحليل بفتح الصور في برنامج Image J. وإذا كانت الصور بتنسيق مكدس متعدد الألوان، فقم بفصل القنوات الفردية عن طريق تحويلها إلى hyper stack من خلال تحديد الصورة.بعد ذلك، اختر hyper stack ثم stack to hyper stack. ستفتح نافذة convert to hyper stack مع ظهور الإعدادات المعروضة، انقر موافق. ستظهر الصورة الآن مع وجود شريطي تمرير أسفلها.لتقسيم الصور إلى مجموعات ذات قناة واحدة، انقر فوق الصورة واختر hyper stack reduce dimensionality. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة reduce، تأكد من تحديد frames وkeep source، ثم انقر فوق Okay.ستظهر صورة جديدة تحتوي على قناة واحدة فقط. كرر هذه العملية لإظهار صورة جديدة بالقناة الثانية. بعد ذلك، ولزيادة الوضوح البصري للصور النهائية، اختر YFP excitation YFP emission stack.انقر فوق "process"، ثم انقر فوق "math". بعد ذلك، اختر "multiply". عندما تفتح نافذة "multiply"، أدخل القيمة ثلاثة لضرب مكدس إثارة YFP وانبعاث YFP في ثلاثة. هذه الخطوة اختيارية وتضمن ألا تكون النسب في النطاق ما بين صفر وواحد.بعد ذلك، من شريط أدوات ImageJ، اختر أداة الرسم الحر (freehand tool). ثم في مكدس إثارة YFP وانبعاث YFP، ارسم منطقة اهتمام (ROI) في منطقة خالية من الخلايا، ولكنها قريبة من خلية سيتم قياسها؛ ولإضافة منطقة الاهتمام إلى مدير مناطق الاهتمام (ROI manager)، انقر على أدوات التحليل (analyze tools)، ثم مدير مناطق الاهتمام (ROI manager).ستظهر نافذة مدير منطقة الاهتمام (ROI manager). انقر على add لحفظ إحداثيات منطقة الاهتمام لقياس متوسط الشدة لمنطقة الاهتمام في مكدس استثارة YFP وانبعاث YFP. انقر على analyze، ثم اختر measure.ستفتح نافذة النتائج. حدد مجموعة صور إثارة CFP وانبعاث YFP. ثم انقر نقراً مزدوجاً على منطقة الاهتمام (ROI) في مدير مناطق الاهتمام (ROI manager) وأعد عملية القياس.تتم إضافة القياس إلى نافذة النتائج. قم بالتمرير إلى مواضع أخرى في المكدس لتكرار هذه العملية عند نقاط زمنية متعددة. تحقق من أن شدة الخلفية القريبة من الخلية المستهدفة متشابهة في جميع أنحاء الفيلم من خلال مقارنة القياسات في نافذة النتائج.لضبط القياسات بحيث تشمل الحد الأدنى من الكثافة، انقر فوق analyze، ثم انقر فوق set measurements وحدد القيمة الرمادية الدنيا والقصوى. ستظهر نافذة تعرض بدائل القياس بعد ذلك. بعد ضبط السطوع والتباين حسب الضرورة، ارسم منطقة اهتمام (ROI) تغطي معظم الخلية وقم بقياس الحد الأدنى من الكثافة في كلتا المجموعتين (stacks).ثم قم بأخذ القياسات كما سبق، ولكن باستخدام خلية هذه المرة بدلاً من الخلفية. وباستخدام القيم الواردة في أقسام النتائج، احسب الفرق بين أقل شدة مقاسة وشدة الخلفية ثم اقسم الناتج على اثنين. يوفر هذا تقديراً أولياً لقيمة القص (clipping value) بالنسبة لنسبة الفتح في بعض الملحقات الإضافية المختارة.بعد ذلك، اختر ratio plus. ثم بالنسبة لنسبة FRET، حدد CFP excitation YFP emission S stack one، أو بالنسبة لنسبة FRET المعكوسة لتصور المجسات التي تنخفض فيها كفاءة FRET عند الفسفرة، حدد YFP excitation YFP emission S stack one لإدراج قيم شدة الخلفية المقاسة وقيم القص (clipping values).استخدم القيم من نافذة النتائج والصقها في نافذة ratio plus. حدد مقياس التدرج لمجموعة الصور الناتجة (ratio stack) وطبق جدول بحث (lookup table) مناسب لتصور التغيرات في النسبة. تم تصوير خلايا U2 OS التي تعبر عن مسبار يعتمد على تقنية FRET لمراقبة نشاط PLK1 لمدة 60 ساعة كما هو موضح في هذا الفيديو.تظهر هذه الصورة الدخول التراكمي في الانقسام الفتيل لـ 50 خلية تعبر عن مسبار fret، بما في ذلك انقسامات الخلايا الوليدة. تتكاثر غالبية الخلايا التي تعبر عن المسبار بزمن دورة خلية يتراوح بين 20 و 25 ساعة، مما يشير إلى أن ظروف التصوير ومستويات تعبير المسبار لا تؤثر على توقيت دورة الخلية. ويوضح تمثيل بالألوان الزائفة لنسبة fret المعكوسة، من خلال تتبع خلية واحدة عبر أربعة انقسامات، أنه على الرغم من وجود ضوضاء ملحوظة، إلا أنه يُلاحظ وجود اتجاه تزداد فيه نشاط PK one في طور G two ويصل إلى ذروته أثناء الانقسام الفتيل.عندما يتم ترشيح البيانات الخام باستخدام مرشح المتوسط وعرضها في شكل رسم بياني، يسهل تقدير الوقت بين ذروات النشاط. يوضح هذا الشكل كمية نسبة FRET المعكوسة للخلية الموضحة في الصور السابقة من الرسم البياني. يمكن تقدير توقيت التنشيط، وكما يتضح هنا، تصبح فسفرة المسبار مرئية قبل حوالي أربع ساعات من وصول الفسفرة إلى ذروتها في الانقسام الفتيلي.أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على الخلايا في حالة خالية من الإجهاد، ويتم ذلك عن طريق تقليل التعرض للضوء بالإضافة إلى تقليل التغيرات في درجة الحرارة أو pH. ومن المهم أيضاً تذكر أن هذه الطريقة تراقب التوازن بين نشاط الكيناز والفسفاتاز في الخلية. يمكن دمج هذا الإجراء مع تداخل RNA أو فحوصات المثبطات لتحديد المنظمات العلوية لهذه الكينازات والفسفاتازات.

monitoring-kinase-phosphatase-activities-through-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

تحديد موقف دورة الخلية من مجموعة من الخلايا ، أو فهم الكيفية التي تؤثر على انتشار الاشارات ، يمكن قياس التدفق الخلوي بسهولة باستخدام هذا البروتوكول. نحن التقرير مقاربة بسيطة التجريبية لخلايا التلوين وقياس موقفهم في دورة الخلية.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) هو تقنية المجهر قوية لمراقبة الوقت الحقيقي من الأحداث يشير في الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار المختلفة وصحفيين. هنا نحن تصف كيفية بناء epifluorescence مخصصة الحنق نظام التصوير من المكونات المتوفرة تجاريا وكيفية استخدامها لتجارب الحنق.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

يصف هذا الفيديو نقل طاقة رنين Förster الذي تم حله بمرور الوقت أو مقايسة TR-FRET لتحديد فسفرة البروتين الداخلي بمساعدة الفلوروفورات المانحة والمتقبلة الموسومة على الأجسام المضادة الخاصة ببروتين الاختبار. تم تصميم هذه التقنية لقياس فسفرة بروتينات الاختبار في محللات الخلايا.

نقل طاقة رنين فورستر الذي تم حله بمرور الوقت لمراقبة فسفرة البروتين في الخلايا

تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

يتم تنشيط في مرحلة دورة الخلية G2 كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) وينظم العديد من المسارات الخلوية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة كيناز في المختبر مع Cdk1، مما يتيح تحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة لتحديد الأهداف الخلوية من هذا كيناز الهامة.

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

يتميز تنشيط Ser/Thr kinase AURKA متعدد الوظائف بفسفرته الذاتية على Thr288. يمكن لمجسات الفلورسنت التي تعتمد على FRET التمييز بين حالاتها غير النشطة والمنشطة. هنا ، نوضح بعض الاستراتيجيات لهندسة المسبار ، جنبا إلى جنب مع بروتوكول FRET السريع لمتابعة تنشيط كيناز في جميع أنحاء الانقسام.

المراقبة في الوقت الحقيقي لتنشيط Aurora kinase A باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET التوافقية في الخلايا الحية

يتم وصف بروتوكولات الفحص الخلوي القائم على خلايا نقل طاقة Förster التي تم حلها عبر الزمن من أجل التحديد الكمي البسيط والمحدد والحساس والقوي لمحول الإشارة المفسفرة الداخلي ومنشط النسخ (STAT) 1/3/4/5/6 البروتينات في محللات الخلايا بتنسيق 384 بئرا.

مقايسات نقل طاقة الرنين Förster التي تم حلها بمرور الوقت لقياس بروتينات STAT المفسفرة الداخلية في الخلايا البشرية

هنا ، نقدم بروتوكولا لإثراء فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتين الداخلي المنشأ وبروتيناتها المتفاعلة من الخلايا والأنسجة وتحديدها وتحديدها كميا بواسطة البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي.

نهج قائم على قياس الطيف الكتلي لتحديد فوسفاتيز فوسفوبروتين وتفاعلاتها

يوضح البروتوكول المقدم في هذه الدراسة فعالية كاشف الفرق cAMP في الموقع  في قياس cAMP من خلال طريقتين. تستخدم إحدى الطرق مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا مع خلايا HEK-293. توضح الطريقة الأخرى خلايا HASM الفردية تحت مجهر الفلورسنت.

ديناميكيات cAMP في الوقت الفعلي في الخلايا الحية باستخدام كاشف فرق cAMP الفلوري في الموقع

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد الديناميكيات الزمانية المكانية لتنشيط Akt والفسفرة في خلايا HepG2 الحية. يعد تصوير فورستر لنقل الطاقة بالرنين (FRET) أداة قوية توفر رؤى قيمة حول مسارات إشارات الأنسولين وتنظيم التمثيل الغذائي في الخلايا السرطانية.

تصوير نقل طاقة رنين الخلية الحية لديناميكيات تنشيط Akt المنظمة الأيضية في خلايا HepG2

اكتشف مراقبة نشاط الكيناز والفوسفاتيز خلال دورة الخلية باستخدام تقنية FRET في خلايا U2 OS. توفر هذه الطريقة رؤية مباشرة لتغيرات الفسفرة في الوقت الفعلي.

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

استكشف المزيد من الفيديوهات