رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

في هذا الفيديو، تتم مراقبة أنشطة كيناز وفوسفاتيز طوال دورة الخلية باستخدام نقل طاقة الرنين من فورستر أو الحنق. هنا يحتوي مسبار نشاط البولو مثل كيناز واحد أو LK على بروتين فلورسنت سماوي CFP يوضع على أحد طرفيه وبروتين الفلورسنت الأصفر YFP على الطرف الآخر. يتم تحويل هذا المسبار إلى خلايا U2 OS.

ثم لفحص حالة الفسفرة لأهداف LK واحدة أثناء انتقال G اثنين من M ، تخضع خلايا TRANSFECTED U2 OS للتصوير الفلوري بفاصل زمني. عندما يكون CFP و YFP على مقربة من بعضهم البعض ويكون CFP متحمسا ، يتم نقل الطاقة إلى YFP ويمكن اكتشاف قبول YFP. ومع ذلك ، عندما يصبح المسبار فسفريا ، فإن التغيير التأكيدي في البروتين يفصل بين CFP و YFP.

الآن عندما يكون CFP متحمسا ، يتم الكشف عن انبعاث CFP قوي وانبعاث YFP ضعيف فقط ، والتقدير الكمي لنسبة انبعاث YFP بعد كل من إثارة CFP و YFP يوضح أن نشاط PLK واحد يزداد في G اثنين ويبلغ ذروته أثناء الانقسام. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التصوير الهندسي القياسي ، هي أنه يتم إيلاء اهتمام خاص إلى أن دورة الخلية لا تتزعج سواء من خلال ظروف التصوير أو عن طريق التعبير عن المسبار. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال دورة الخلية ، مثل مكان ووقت تنشيط كينازات أو فوسفاتاز معينة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للإنزيمات المنظمة لدورة الخلية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأنظمة الأخرى التي تتطلب شروط غير قابلة للتغيير ، مثل فحوصات تكاثر الخلايا. لمراقبة دورة الخلية البشرية ، يتم نقل خلايا U2 OS باستخدام مسبار نشاط PK واحد قائم على الحنق. باستخدام طريقة تعداء فوسفات الكالسيوم القياسية ، يتم اختيار الخلايا في الميسين النقي لمدة سبعة أيام على الأقل.

هذا يثري عدد الخلايا التي تعبر عن المسبار ويحد من عدد الخلايا ذات مستويات التعبير السامة أو مستويات التعبير التي تؤثر بشدة على دورة الخلية. ثم يتم اختيار المستنسخة المستقرة عن طريق التعبير المحدود عن CFP ثم يتم فحص YFP للتحقق من وجودها في جميع الخلايا بنفس النسبة تقريبا. إذا كانت بعض الخلايا تحتوي على CFP فقط أو إعادة تركيب YFP قد حدث على الأرجح في هذه الحالة ، كرر تحضير البلازميد باستخدام البكتيريا الأقل عرضة لإعادة التركيب المتماثل ، مثل خليتين مؤكدتين ثم خطية البلازميد وكرر التعداد.

بمجرد أن تعبر الخلايا بثبات عن المسبار ، قم بزرعها في أطباق ذات قاع زجاجي رقم 1.5 بعد أن يتم ربطها وتكون متقاربة بنسبة 30 إلى 50٪. قم بتغيير الوسط إلى وسيط مستقل عن ثاني أكسيد الكربون ولا يحتوي على فينول أحمر قم بتركيب الخلايا على مجهر مضان epi آلي مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. يجب أن يكون المجهر مزودا بمرشحات الإثارة والانبعاث CFP و YFP.

مرآة ROIC مناسبة لمراقبة CFP و YFP وهدف مناسب للحل المطلوب. هنا ، يتم استخدام هدف جوي 20 × NA 0.75. باستخدام الضوء المنقول ، اجعل الخلايا في بؤرة التركيز.

لا تستخدم ضوء الفلورسنت في هذه المرحلة لأنه سيؤدي إلى استجابة إجهاد قد تزعج دورة الخلية. لتجنب السمية الضوئية ، اضبط الانحناء على الحد الأقصى المتاح الذي يسمح بالدقة المطلوبة تحت الخلوية. في هذه التجربة ، يجب أن يكون من الممكن التمييز بين النواة والسيتوبلازم.

اضبط وقت تعريض ضوئي قصيرا وأدخل مرشحا عالي الكثافة محايدة. ثم احصل على صورة اختبار 12 أو 16 بت باستخدام الإثارة والانبعاث YFP ، اضبط وقت التعرض ومرشحات الكثافة المحايدة بحيث يكون متوسط الكثافة في الخلية مساويا تقريبا لشدة الخلفية بالإضافة إلى خمسة أضعاف الفرق بين الحد الأدنى والأقصى لشدة الخلفية. للتحقق من أن الصور غير مشبعة ، افحص شدة التألق لصورة العينة.

يجب أن تكون الكثافة القصوى في الصورة أقل من نصف النطاق الديناميكي للسماح باختلافات الشدة عندما تدخل الخلايا في الانقسام. بعد ذلك ، كرر هذه العملية باستخدام مرشحات الإثارة CFP و YFP. حدد مناطق متعددة ذات خلايا منقولة، باستثناء المناطق المستخدمة للتركيز وتحسين ظروف التعريض الضوئي.

نظرا لأن هذه الإجراءات قد تكون قد استدعت استجابة الإجهاد ، فتأكد من أن الشدة القصوى أقل من نصف النطاق الديناميكي في جميع الخلايا. قم بتوجيه البرنامج للحصول على صورتين كل 45 دقيقة باستخدام إثارة YFP وانبعاث YFP وإثارة CFP. مرشحات انبعاث YFP.

اضبط أيضا الطول الإجمالي للتجربة ليتجاوز مدة دورة الخلية. بمجرد ضبط كل شيء ، ابدأ في الحصول على الصور بعد اكتمال الاستحواذ ، وافتح الصور المكتسبة وراقب وقت دورة الخلية من الانقسام إلى الانقسام. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن المسبار المنقول هنا ، كان وقت دورة الخلية حوالي 20 إلى 25 ساعة.

قارن هذا ببيانات التحكم لنوع الخلية المستخدمة. إذا كان وقت دورة الخلية يتوافق مع التوقيتات المرجعية ، فيمكن تحليل الحنق. بمجرد التحقق من التوقيت ، يمكن تحليل الصور.

يمكن إجراء التحليل بواسطة معظم البرامج المخصصة للفحص المجهري. هنا ، يتم استخدام البرنامج المجاني للصورة j مع النسبة بالإضافة إلى البرنامج المساعد. ابدأ التحليل بفتح الصور في Image J.إذا كانت الصور بتنسيق مكدس متعدد الألوان ، فافصل القنوات الفردية عن طريق تحويلها إلى مكدس فائق عن طريق تحديد الصورة.

ثم المكدس المفرط ثم المكدس إلى المكدس المفرط. تفتح نافذة التحويل إلى المكدس الفائق مع عرض الإعدادات ، انقر فوق موافق. سيتم الآن عرض الصورة مع شريطين منزلقين تحتها.

بجانب تقسيم الصور إلى مكدسات قناة واحدة ، انقر فوق الصورة وحدد hyper stack تقليل الأبعاد. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة التقليل ، والتأكد من تحديد الإطارات والحفاظ على المصدر. ثم انقر فوق موافق.

ستظهر صورة جديدة تحتوي على قناة واحدة فقط. كرر هذه العملية لإظهار صورة جديدة مع القناة الثانية. بعد ذلك ، لزيادة الوضوح المرئي للصور النهائية ، حدد مكدس انبعاث YFP للإثارة YFP.

انقر فوق العملية ، ثم انقر فوق الرياضيات. ثم اضرب عند فتح نافذة الضرب ، أدخل ثلاثة لضرب مكدس انبعاث YFP لإثارة YFP في ثلاثة. الخطوة اختيارية وتضمن أن النسب ليست في النطاق بين صفر وواحد.

بعد ذلك ، على شريط أدوات الصورة J ، حدد الأداة اليدوية. ثم في إثارة YFP ، مكدس انبعاث YFP ، ارسم منطقة اهتمام أو عائد استثمار في منطقة خالية من الخلايا ، ولكنها قريبة من خلية سيتم قياسها لإضافة عائد الاستثمار إلى مدير عائد الاستثمار ، انقر فوق أدوات التحليل. ثم مدير العائد على الاستثمار.

ستظهر نافذة مدير عائد الاستثمار. انقر فوق إضافة لحفظ إحداثيات عائد الاستثمار لقياس متوسط شدة عائد الاستثمار في مكدس انبعاث YFP لإثارة YFP. انقر فوق تحليل ، ثم حدد قياس.

سيتم فتح نافذة النتائج. حدد مكدس الانبعاثات YFP لإثارة CFP. ثم انقر نقرا مزدوجا فوق عائد الاستثمار في مدير عائد الاستثمار وكرر القياس.

تتم إضافة القياس إلى نافذة النتائج. قم بالتمرير إلى أماكن أخرى في المكدس لتكرار هذه العملية في نقاط زمنية متعددة. تحقق من أن شدة الخلفية القريبة من الخلية محل الاهتمام متشابهة في جميع أنحاء الفيلم من خلال مقارنة القياسات في نافذة النتائج.

لتعيين القياسات لتشمل الحد الأدنى من الكثافة ، انقر فوق تحليل ، ثم انقر فوق تعيين القياسات وحدد الحد الأدنى والحد الأقصى للقيمة الرمادية. ستظهر نافذة تعرض بدائل القياس بعد ذلك. بعد ضبط السطوع والتباين حسب الضرورة، ارسم عائد استثمار يغطي معظم الخلية وقم بقياس الحد الأدنى من الكثافة في كلا المكدسين.

ثم قم بإجراء القياسات كما كان من قبل هذه المرة باستخدام خلية بدلا من الخلفية. باستخدام القيم من أقسام النتائج ، احسب الفرق بين الحد الأدنى للشدة المقاسة وكثافة الخلفية وقسمها على اثنين. يوفر هذا تقديرا أوليا لقيمة القطع إلى نسبة الفتح بالإضافة إلى المكونات الإضافية المحددة.

ثم نسبة زائد. ثم بالنسبة لنسبة الحنق ، حدد مكدس انبعاث YFP لإثارة CFP واحد أو لمجسات تصور نسبة الحنق المقلوبة حيث تنخفض كفاءة الحنق عند الفسفرة. حدد مكدس انبعاث YFP S واحد لإدراج شدة الخلفية المقاسة وقيم القطع.

استخدم القيم من نافذة النتائج والصقه في نافذة النسبة زائد. قم بتعيين قياس مكدس النسبة الناتجة وقم بتطبيق جدول بحث مناسب لتصور تغييرات النسبة. تم تصوير خلايا U2 OS التي تعبر عن مسبار قائم على الحنق يراقب نشاط PLK واحد لمدة 60 ساعة كما هو موضح في هذا الفيديو.

تظهر هذه الصورة الدخول الانقسامي التراكمي ل 50 مسبار الحنق الذي يعبر عن الخلايا ، بما في ذلك انقسامات الخلايا الوليدة. تتكاثر غالبية الخلايا التي تعبر عن المسبار مع وقت دورة خلية يتراوح بين 20 و 25 ساعة ، مما يشير إلى أن ظروف التصوير ومستويات التعبير عن المسبار لا تؤثر على توقيت دورة الخلية. يوضح تمثيل اللون الخاطئ لنسبة الحنق المقلوب بعد خلية واحدة من خلال أربعة أقسام أنه على الرغم من وجود ضوضاء كبيرة ، إلا أنه يظهر اتجاه يزداد فيه نشاط PK واحد في G اثنين ويبلغ ذروته أثناء الانقسام.

عندما يتم تصفية البيانات الأولية وتقديمها كرسم بياني ، فمن السهل تقدير الوقت بين ذروة النشاط. يوضح هذا الشكل القياس الكمي لنسبة الحنق المقلوب للخلية الموضحة في الصور السابقة من الرسم البياني. يمكن تقدير توقيت التنشيط وكما يتضح هنا ، تصبح فسفرة المسبار مرئية قبل حوالي أربع ساعات من وصول الفسفرة إلى ذروتها في الانقسام.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إبقاء الخلايا في حالة عدم الإجهاد ، لذلك يتم ذلك عن طريق تقليل التعرض للضوء وكذلك لتقليل التغيرات في درجة الحرارة أو درجة الحموضة. من المهم أيضا أن تتذكر أن هذه الطريقة تراقب التوازن بين نشاط كيناز وفوسفاتيز في الخلية. يمكن دمج هذا الإجراء مع تداخل الحمض النووي الريبي أو شاشات المثبطات لتحديد منظمات المنبع لهذه الكينازات والفوسفاتيز.