مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

تُستخدم هذه الطريقة التجريبية للكشف عن خصائص دخول الكالسيوم الذي يتم تشغيله عبر المخازن (SOCE) في الخلايا السرطانية وخلايا العضلات الهيكلية باستخدام طرق تعتمد على الفلورة. ويتحقق ذلك عن طريق تسجيل فلورة URA two في الخلايا الحية، وهو مؤشر حساس لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يتم قياس معدل إخماد الفلورة عند إضافة المنجنيز عند طول موجي غير حساس لتركيز الكالسيوم، وهو ما يعكس بشكل مباشر تنشيط SOCE لدراسته.

في الخلايا العضلية الهيكلية المتخصصة بنيوياً، يتم تشريح العضلات وإزالة الغلاف الخارجي لها. ثم يتم تحضير الألياف العضلية، وبعد ذلك تُعالج الألياف بمؤشرات كالسيوم منخفضة الألفة ويتم رصد الفلورة الداخلية لها.

تُظهر هذه الطرق أن دخول الكالسيوم عبر القنوات التي تعمل بتنشيط المخزون (SOCE) موجود في كل من الخلايا غير القابلة للإثارة والعضلات الهيكلية، مع تنشيط متدرج وارتباط وثيق بمحتوى مخزون الكالسيوم داخل الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية القائمة على الفلوريسين مقارنة بالطرق الأخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربائية وتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp)، في سهولة استخدامها وإمكانية تطبيقها على دراسة المجموعات الخلوية أو الفحص عالي الإنتاجية. ومن المهم استخدام المحاليل المنظمة المناسبة لبيئة القياسات المترية ومقايسة المغنيسيوم.

لذا، فإن معايرة كل جهاز على حدة أمر بالغ الأهمية لأن كل جهاز يختلف عن الآخر. ويعد التوضيح المرئي لهذه الطريقة ضرورياً لأن عملية تحضير القشرة الميكانيكية للألياف العضلية المنفردة يصعب تعلمها، حيث تتطلب تدريباً عملياً خاصاً وفهماً عميقاً وتعلم تقنيات التشريح الدقيق، والملاحظة الدقيقة، وقدراً كبيراً من الصبر. قبل البدء، قم بمعايرة إعدادات المجهر لقياس فلورة URA2. وعلى الرغم من أن أطوال موجات الاستثارة لارتباط الكالسيوم وURA2 هي 340 و380 nanometer، فإن أفضل نطاق ديناميكي لنسبة URA2 لقياس الكالسيوم قد يتحقق عند أطوال موجية أخرى في نظام مجهري معين.

تنتج هذه الإزاحات في الأطوال الموجية عن التغيرات في المسار البصري مع إضافة المكونات البصرية المختلفة. وبالمثل، تختلف نقطة ISO spastic لكل نظام أيضاً. لذا، من المهم تحديد هذه الأطوال الموجية عن طريق مسح الطيف.

بدلاً من ذلك، يمكن تسجيل مسح Ming بواسطة الفلورة عند أي طولين موجيين بحيث تكون القيمة النهائية مستقلة عن تركيز الكالسيوم. ابدأ بنقل الخلايا المستزرعة K Ys SE one 50 باستخدام بلازميدات تعبر عن RFP وتحتوي إما على HRNA موجه خصيصاً ضد I one أو تسلسل عشوائي لمدة 48 ساعة. قم بتنمية الخلايا المنقولة على أطباق ذات قاع زجاجي.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا بمحلول ملحي متوازن أو BSS. بعد الغسل، أضف 1 mL من BSS الذي يحتوي على 2 µM من RA 2:00 AM وحافظ على الطبق عند 37 °C لمدة 40 دقيقة. ضع الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح بتحويل شكل URA 2:00 AM داخل الخلايا إلى URA two.

بعد ذلك، اغسل الطبق مرتين باستخدام BSS تحت المجهر. وفي وضع التصور، اختر الخلايا التي تعبر عن RFP. اختر وضع نسبة الاستثارة مع ضبط طول موجة الانبعاث عند 510 nanometers وأطوال موجات الاستثارة عند 350 و390 nanometers.

تظهر النسبة في النافذة الثالثة. بعد ذلك، قم بالتسجيل. يتم قياس الفلورة للخلايا المختارة عند الأطوال الموجية المحددة مسبقاً بينما يتم تروية الخلايا بأربعة محاليل مختلفة.

وبالمثل، يتم تحميل خلايا KYSE 50 بـ ferra 2 وإخضاعها للتسجيل. وفي وضع نسبة الاستثارة، وبخلاف الإجراء السابق، يتم اختيار نقطة ISO spastic 360 nanometers كطول موجي للاستثارة. ثم يتم تسجيل الفلورة في آن واحد عند 360 و390 nanometers بينما يتم تروية الخلايا بخمسة محاليل BSS مختلفة.

لهذا البروتوكول، يجب زراعة خلايا C2C12، وهي خط خلايا عضلية فأرية، على أطباق ذات قاع زجاجي حتى تصل إلى مرحلة الالتحام، ثم تمايزها إلى أنابيب عضلية في وسط تمايز يحتوي على 2.5% مصل حصان. قم بتحميل أنابيب C2C12 العضلية بتركيز نهائي قدره 5 µM من RA 2:00 AM في محلول BSS وحضنها لمدة 40 دقيقة. ثم أضف تركيزاً نهائياً قدره 20 µM من benzo p toluene smide أو BTS لتثبيط الانقباضات العضلية والتشوهات الحركية الناتجة عنها.

حضّن الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إبقائها في محلول BTS في جميع المحاليل. بعد ذلك، قم بتعبئة أربعة محاليل ملحية متوازنة في نظام التروية.

كما تم وصفه سابقاً. خلال كل عملية تدفق، قم بتسجيل الفلورة لخلايا مختارة عند 360 و390 نانومتر. في هذه السلسلة، يتم تطبيق المغنيسيوم وthap argen معاً لمراقبة إخماد أيونات المغنيسيوم.

أثناء استنفاد مخازن الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية. لتشريح العضلة الباسطة للأصابع الطويلة (EDL)، ضع ساق فأر تم القتل الرحيم له بشكل جانبي وأزل الجلد من منطقة الكاحل وصولاً إلى الركبة. اقطع طبقات العضلات السطحية للأنسجة للكشف عن عضلة EDL، واقطع الوترين العلوي والسفلي لتحرير عضلة EDL السليمة.

من المهم الحفاظ على طول الأوتار قدر الإمكان. والآن، لمنع حدوث أي انقباضات، انقل عضلة EDL إلى محلول T road يحتوي على 0.1 millimolar EGTA وخالٍ من الكالسيوم تحت مجهر ستريو. اضغط على أوتار إدراج الركبة لتقسيمها إلى نصفين، ثم قسم عضلة EDL إلى حزمتين.

كرر العملية حتى يتم الحصول على ثماني حزم. في حال فقدان الأوتار من أي حزمة، تخلص من تلك الحزمة. بعد ذلك، أمسك بكلا وتري شريط حزمة EDL ومد الشريط بعناية حتى تتبقى ثلاث أو أربع ألياف عضلية مفردة منفصلة وسليمة مع وجود نسيج وتري على كلا الجانبين.

ضع قطرة من محلول تيرو المنظم الخالي من الكالسيوم في طبق ذو قاع زجاجي. ضع شرائح EDL بشكل مستقيم على الطبق وأزل أكبر قدر ممكن من المحلول بسرعة. بعد ذلك، قم بتثبيت كلا الوترين بإحكام باستخدام شريط لاصق مقاوم للماء.

اغسل الليفة أولاً بالمحلول الخالي من الكالسيوم، ثم مرتين بمحلول كالسيوم بتركيز 2.5 millimolar. في حال حدوث انكماش مفرط في الليفة وملاحظة تلفها، تخلص من هذه الليفة، واغسل ألياف العضلات السليمة المختارة ثلاث مرات بمحلول الغسيل رقم واحد، ثم اغمرها في محلول تقشير معدل شبيه بداخل الخلايا لمدة خمس دقائق. وباستخدام إبرة تنجستن مثبتة على حامل دبابيس، قم بتقشير الليفة ميكانيكياً تحت مجهر ستيريو؛ حيث ستنغلق الألياف مجدداً وتحبس road five n المقترن بالكالسيوم داخل الأنيبيبات المستعرضة.

يعتبر الحصول على ألياف عضلية سليمة ومنفردة وصحية، أو على الأقل حزم من هذه الأنواع من الألياف التي لا يزال جزء من الوتر متصلاً بها، في رأيي، أحد أكثر الخطوات تحدياً، يليه عملية نقل هذه الألياف إلى غرفة التجارب النهائية والتي تكون صعبة للغاية دائماً. خلال هذه العملية، قد تتعرض الألياف لانقباض مفرط أو قد تنكسر. لذا، إذا كانت الألياف صحية، فإن عملية التجريد الميكانيكي نفسها ستكون أسهل بكثير لتحميل SR. قم بتحضين الألياف في محلول التجريد الذي يحتوي على 20 µM من flow five N am.

اتبع عملية التحضين بغسلات مكثفة باستخدام محلول الغسيل رقم اثنين، مع تحضين إضافي لمدة 30 دقيقة للسماح بإزالة مجموعة الإستر بالكامل من الصبغة. يمكن بعد ذلك تصوير الألياف باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) بعدسة شيئية بقوة 60x في المناطق ذات الأهمية. قم بتسجيل الفلورية لكل صبغة بشكل متزامن أثناء تروية الليف بمحاليل SR loading و SR Depletion.

تم فحص نشاط SOCE في خلايا KYS, SE one 50 باستخدام قياس الكالسيوم داخل الخلايا. تم ترانسفكشن الخلايا بـ RFP وشريط دبوسي قصير من RNA ضد جين OR I one، الذي يشفر قناة A-S-O-C-E، مقارنة بعينات الضبط الممثلة بالخط الأسود؛ وقد أدى تثبيط تعبير OR I one إلى انخفاض نشاط SOCE. كما تم تأكيد SOCE في خلايا KYC one 50 باستخدام مقايسة إخماد المنجنيز. وبعد أن قام TG باستنفاد مخازن الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية تماماً، أدى تدفق المنجنيز إلى انخفاض ملحوظ في الفلورة.

يشير المنحدر الأكثر حدة لفقدان إشارة URA two إلى نشاط أكبر لعملية SOCE. وبذلك، فإن الانخفاض البطيء في الفلورة في الخلايا المعالجة بـ two A PB يشير إلى أن نشاط SOCE قد تم تثبيطه بواسطة هذا المركب. وقد تم تحديد معدلات إخماد المنجنيز من الثواني العشر الأولى حيث كان الإخماد لا يزال في النطاق الخطي دون تشبع، كما أُجري اختبار مماثل لإخماد المنجنيز في خلايا عضلية مستزرعة.

في هذه الحالة، تم تطبيق المنجنيز بالتزامن مع tg. وبينما كان TG يستنفد مخازن الكالسيوم في الشبكة الساركوبلازمية (SR)، تغير منحدر إخماد الفلورة تدريجياً حتى وصل إلى أقصى معدل له. وقد أشار المنحنى السيني إلى التنشيط المتدرج لدخول الكالسيوم عبر القنوات التي تعمل بتنشيط من المخازن (SOCE) تحت هذه الظروف التجريبية.

تحت التصوير البؤري، أظهر احتجاز rhodamine 5 و dye في مقصورة TT نمط الثنائيات المميز للثدييات كما ظهر في القناة الحمراء. وبعد تحميل SR بـ fluo 5N، ظهر نمط SR المنقّط النموذجي في القناة الخضراء عند غمر الليف المقشر بمحلول تحميل TTSR. وزادت شدة الفلورسنت لكل من rhodamine 5N و fluo 5N عند الغمر بمحلول استنفاد SR، وبدأت مستويات الفلورسنت في مقصورة SR ومقصورة TT في الانخفاض. وقد أشار ذلك إلى وجود اقتران بين استنفاد مخزون الكالسيوم في SR وتنشيط SOCE على التوالي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد للغاية لكيفية الحصول على ألياف عضلية سليمة وحيوية وصحية للغاية في البداية. يجب أن تحتوي هذه الألياف على قدر كافٍ من الوتر عند أطرافها للسماح بعملية تثبيت فعالة، مما سيمكن الباحث في نهاية المطاف من الحصول على تحضير ذي صلة فسيولوجياً يتميز بميزة هائلة. لا تنسَ أن جميع الصبغات الفلورية المستخدمة في هذه الدراسة تكون عادةً حساسة للضوء، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل التحميل في أطباق مظلمة والغسيل في غرفة مظلمة، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

يمكن تنفيذ هذه التقنية بمجرد إتقانها في غضون ساعات قليلة. ونحن نقترح الحصول أولاً على عدة ألياف سليمة لضمان نسبة نجاح أعلى في الخطوات الميكانيكية الدقيقة، وأيضاً إذا كنتم ترغبون في استزراع هذه الألياف طوال الليل بعد تطويرها. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال إشارات الكالسيوم لاستكشاف دور دخول الكالسيوم عبر القنوات التي تعمل بالمخزون في نمو الخلايا السرطانية وموتها.

الوظيفة الفسيولوجية والباثولوجية في العضلة.