طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

مرحبا ، أنا جيرسي. مرحبا ، اسمي شابي وكلانا باحثان ما بعد الدكتوراه في إمبريال كوليدج في لندن ، نعمل مع البروفيسور أندرو دي ميلو والدكتور جوش ديل في منصات قطرات الموائع الدقيقة. منصات الموائع الدقيقة القائمة على القطرات تعد المرشحين لتجربة إنتاجية أعلى لأنه يمكن إنشاؤها بأحجام عالية جدا محددة بدقة ومسابقاتها ، يمكن أن يصل تردد التوليد إلى عدة كيلوغرامات في الفرد.

علاوة على ذلك ، نظرا لأنه يمكن تغليف منطقة الاهتمام في مقصورات لاحقة تصل إلى بضعة لترات ، يمكن التخلص من كل من الحديث المتبادل والتشتت ، ويمكن توقيت العمليات التحليلية بدقة أكبر. في مجموعتنا ، نجحنا بالفعل في تنفيذ منصات القطرات الصغيرة للعديد من التطبيقات. على سبيل المثال ، تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتخليق الجسيمات النانوية ، ومقايسة الخلية الجزيئية الفردية.

يجب استخراج الكميات الكبيرة من المعلومات التي تم إنشاؤها داخل هذه الأنظمة وتسخيرها واستخدامها بكفاءة. في هذا الصدد ، يجب أن تكون طريقة الكشف المختارة صحيحة ، وتوفر حساسية عالية وحدود منخفضة للكشف ، وأن تكون قابلة للتطبيق على مجموعة من الأنواع الجزيئية ، وأن تكون غير مدمرة ، وتكون قادرة على التكامل مع أجهزة الموائع الدقيقة بطريقة سهلة. لتلبية هذه الحاجة ، قمنا بتطوير مجموعة من الأدوات والبروتوكولات التجريبية التي تمكن من استخراج كميات كبيرة من المعلومات المادية من بيئات صغيرة الحجم ، وهي قابلة للتطبيق على تحليل مجموعة واسعة من الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية.

في هذا البروتوكول ، سنقدم للطرق التي يتم تطبيقها للكشف عن الخلايا المفردة ورسم خرائط عمليات الخلط في Dropbox. يتم تصنيع رقائق الموائع الدقيقة تقليديا في بولي ثنائي ميثيل سلون PGMS باستخدام طرق الطباعة الحجرية الضوئية. يجب أن تتم هذه العملية في منشأة غرفة نظيفة للحصول على قنوات الموائع الدقيقة Spinco ، SU ثمانية 50 على خبز ناعم من رقاقة السيليكون على صفيحة ساخنة عند 65 درجة و 95 درجة لتبخير المذيب وتكثيف الفيلم بعد التبريد ، وكشف SU ثمانية ، ومقاومة الأشعة فوق البنفسجية تحت القناع المناسب ، ثم تخبز الرقاقة على حرارة 65 درجة و 95 درجة بعد التبريد.

قم بتطوير المناطق غير المكشوفة باستخدام محلول التطوير المناسب أثناء التحريك. استخدم مذيب EC طازج لشطف الرقاقة ثم تجفيفها تحت الغاز لتوليد سطح نظيف. عالج الرقاقة بغسول الهكسان والميثانول.

أيضا لإكمال عملية التصنيع الرئيسية ، قم بتبخير عامل الاستيلاء على السطح في حالة تجفيف لمدة 40 دقيقة. لتشكيل ركائز الموائع الدقيقة الهيكلية ، نقوم بخلط واقي S 1 8 4 بنسبة 10 إلى واحد من الرابط الراتنجي ونقوم بسحبها فوق السيد. Degas هذا في الجفاف وعلاج الجهاز عند 65 درجة.

اقطع PDMS المعالج وقشره من السيد. قم بإنشاء فتحات وصول للأنابيب السائلة باستخدام ثقب الخزعة. عالج طبقة أخرى من PDMS لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة.

ضع الطبقة العليا المحضرة على الطبقة السفلية وقم بمعالجتها طوال الليل عند 65 درجة. قشر الرقائق من طبق بتري وقطعها إلى مكعبات. بمجرد تصنيع الرقائق ، تصبح جاهزة للاستخدام عن طريق غرس الحلول ذات الأهمية.

املأ المحاقن بالمحاليل المطلوبة ، مع ضمان عدم وجود فقاعات هواء في أي جزء من الأنبوب. لتوليد القطرات ، يتم استخدام مرحلتين. تحتوي المرحلة المائية المشتتة على الكواشف ذات الأهمية.

تعمل مرحلة الزيت كأنبوب مناسب للطور المستمر بنفس القطر الداخلي مثل أطراف إبرة المحقنة على أحد طرفيها للإبر ، وتركيب المحاقن على مضخة حقنة وتحديد معدل تدفق الحقن المطلوب. لكل مرحلة ، يوصى بنسبة الحد الأدنى من معدلات التدفق المائي للزيت بمقدار واحد لتجنب ترطيب PDMS بواسطة المرحلة المائية ، مما قد يؤدي إلى تكوين قطرات غير مستقرة. قم بتوصيل الأطراف الأخرى للأنبوب مباشرة بالثقوب المثقوبة في ركيزة PDMS.

للحصول على حلول أكثر تعقيدا ، يمكن أيضا تنفيذ منافذ السيليكا أو الشعيرات الدموية أو الموصلات. قم بتوصيل منفذ مخرج الشريحة بالأنبوب وقم بتوجيهه إلى مجمع لجمع النفايات أو معالجة التحليل الإضافي. بمجرد إعداد ذلك ، هناك تكوينان رئيسيان للقنوات الدقيقة لتوليد تركيز تدفق القطرات أو تنسيق تقاطع T نتيجة للقوى الهائلة التي تنشأ عن استخدام هذه الأشكال الهندسية لجمع السائلين المسموح بهما معا والشعيرات الدموية اللاحقة التي تتطور في الواجهة.

إنشاء قطرات واحدة مشتتة صغيرة مثل بضعة فيمتوليتر تلقائيا. بمجرد إنشاء القطرات ، يمكن فحصها باستخدام إعداد بصري. يتم إعداد النظام البصري على البروتوكول التالي.

استخدم مجهرا متحد البؤر بقدرة تحديد المواقع الآلية دون الميكرون وليزر يعمل بطول موجي يطابق امتصاص شلالات الفلور المعنية. لإثارة حماسهم ، استخدم ليزر نبضي يعمل بمعدلات تكرار تبلغ عدة ميغاهرتز للتصوير الفلوري مدى الحياة. تستخدم تجارب البلغم مرايا توجيه شعاعية وبصريات للتحكم في ارتفاع الشعاع وكذلك اتجاه الحزمة.

استخدم مرآة ثنائية اللون لتعكس شعاع الليزر في العدسة الشيئية. إذا تم استخدام ليزرين في وقت واحد ، فيمكن تركيب مرآة ثنائية مزدوجة النطاق. للسماح بانعكاس حزمتي الليزر ، استخدم هدف مجهر NA عالي الفتحة العددية المصحح بشكل لا نهائي لجعل ضوء الليزر بتركيز محكم داخل قناة ميكروفلويديك.

اجمع التألق المنبعث من العينة داخل قناة الموائع الدقيقة ، باستخدام نفس هدف NA العالي وينتقل عبر نفس المرآة ثنائية اللون. قم بإزالة أي ضوء إثارة متبقي باستخدام مرشح انبعاث أحادي أو مزدوج النطاق. ركز انبعاث التألق على ثقب 75 ميكرومتر.

باستخدام عدسة محدبة بلانو. ضع الثقب في المستوى متحد البؤر لهدف المجهر. استخدم مرآة أخرى ثنائية اللون لتقسيم إشارة الفلورسنت إلى كاشفين.

قم بتصفية التألق الذي تعكسه المرآة ثنائية اللون باستخدام مرشح انبعاث وقم بتركيزه بعدسة محدبة عادية على الكاشف الأول. بالنسبة للتجارب التي تنطوي على فلور أحمر ثانوي ، قم بتصفية التألق الذي تنقله المرآة الثنائية بمرشح انبعاث آخر ، ثم ركزه بعدسة محدبة أخرى على الكاشف الثاني. استخدم الثنائيات الثنائية للصور الجليدية للكشف عن فوتونات الفلورة.

للحصول على بيانات التألق ، قم بإقران الإشارة الإلكترونية من كاشف الصمام الثنائي للصور الانهيارية بجهاز DAQ متعدد الوظائف لتسجيل البيانات الذي يعمل على جهاز كمبيوتر شخصي. بالنسبة لتجارب البلغم ، استخدم ليزر نبضي وقم بتوصيل أجهزة الكشف ببطاقة TCS PC مرتبطة بالوقت لعد الفوتون الفردي التي تعمل على جهاز كمبيوتر منفصل. تسمح هذه البطاقة بالحصول على بيانات عمر الفلورسنت.

استخدام منهجية TCS للكمبيوتر الشخصي. يرتبط كل فوتون فلوري تم اكتشافه بنبض ليزر ساقط ، وبالتالي يتم تعيين وقت تأخير لكل فوتون فلوري منبعث. يمكن تركيب هذه البيانات على منحنى اضمحلال أسي واحد أو متعدد للحصول على تقدير لمعدل إشعاع الفلوروفورات.

نحن نعلم الآن أن الخلايا غير متجانسة للغاية من المنظور البيولوجي والفيزيائي والكيميائي. لذلك ، من الناحية المثالية ، يجب أن نحلل كل خلية في كل مرة. ومع ذلك ، يجب إجراء المقايسات بإنتاجية أعلى حتى نتمكن من جمع معلومات كمية كافية للتوصل إلى نتيجة موثوقة وذات مغزى.

لدينا هنا مثال على تغليف خلايا الإشريكية القولونية في قطرة واحدة ، بحيث يمكن إجراؤها كما هي. استخدم الإي كولي أعلى 10 سلالات تم زراعتها بين عشية وضحاها. من أجل الكشف عن صلاحية الخلايا ، استخدم سيتو تسعة ويوديد البروبيديوم.

كلتا الأصباغ عبارة عن أصباغ متداخلة للحمض النووي وتزداد شدة تألقها بأكثر من 20 ضعفا. عند الارتباط بالحمض النووي cyto nine هي صبغة فلورية خضراء نفاذية للغشاء ويوديد البروبيديوم. إنها صبغة فلورية حمراء ، وهي غشاء غير منفذ.

وبالتالي ، تتألق الخلايا الحية باللون الأخضر بينما تظهر الخلايا الميتة انبعاثات خضراء وحمراء. هنا يمكننا أن نرى توليد القطرات وتغليف خلية واحدة مع تقاطع T. تم تسجيل هذا الفيديو بكاميرا عالية السرعة ، ولكن يمكن إنشاء قطرات بمعدل آلاف في الثانية.

عند تغليف الخلايا ، يجب على المرء التأكد من تخفيف ثقافة الخلايا بحيث يكون هناك عدد أقل من الخلايا من القطرات المتولدة ، ومنع الخلايا من الترسيب ، والتي يمكن أن تحدث في المحقنة أو الأنبوب. استخدم قضيب تحريك مغناطيسي داخل المحقنة للحفاظ على توزيع الخلايا بالتساوي في المحلول. استخدم أنبوبا رفيعا جدا ، 50 ميكرومتر لتوصيل المحقنة بالرقاقة.

هذا يضمن معدل تدفق سريع داخل الأنبوب وبالتالي يمنع الخلايا من الترسيب. فيما يلي الأمثلة النموذجية لعدد الصور كدالة للوقت للتجارب القائمة على الخلايا. لتعيين عمليات الخلط داخل القطرات.

يمكن توليد القطرات باستخدام اثنين من الفلورو الرباعي المختلفين بعمر مختلف. داخل قطرة متدفقة ، يتم إنشاء مجال تدفق ، والذي يمزج في النهاية بين الحلين المنفصلين في الأصل لتعزيز عملية الخلط. يمكن تغيير تناظر مجال التدفق باستخدام قنوات متعرجة.

من أجل فحص القطرات ، قم بتركيز حجم المسبار البصري على نصف ارتفاع القناة الدقيقة التي تتدفق على طولها القطرات ، بدءا من جانب واحد من القناة ، وقم بإجراء كل تجربة على طول عرض القناة بالكامل. على فترات ميكرومتر واحد. قم بتنفيذ خوارزمية للتمييز بين الرشقات النارية المفردة المرتبطة بالقطرات من خلفية الضوضاء لطور الزيت ، وتحديد مدة كل رشقة.

قم بتنفيذ خوارزمية ثانية لاستخراج وقت التأخير وقيم الشدة على طول كل قطرة عند العرض المحدد الذي تم إجراء التجربة فيه. ثم استخدم خوارزمية مقدر الاحتمالية القصوى MLE لتقييم العمر المضان لكل قطرة في التجربة. يؤدي حساب متوسط قيم العمر الافتراضي لجميع القطرات في التجربة إلى تقليل الخطأ النهائي لحساب MLE.

كلما زاد عدد القطرات التي تم فحصها ، كلما كان الخطأ أصغر بمجرد الحصول على مسار مدى الحياة. لكل عرض ، اجمع جميع المسارات في خريطة ثنائية الأبعاد. نظرا لأن كل قيمة مدى الحياة مرتبطة بمزيج معين من أربعة النباتات ، يمكن بالتالي الحصول على خريطة تركيز أو خلط.

لقد وصفنا تصنيع جهاز صغير وإعداد تجريبي والبروتوكولات المرتبطة به لتكوين القطرات الدقيقة وتغليف المنطقة والكشف البصري عن العملية ، القطرات. اختار المثالان الكشف عن الخلايا المفردة في القطرات ورسم خرائط عمليات الخلط. تمثل القطرة المتدفقة داخل التطبيقات الشائعة التي يتم فحصها حاليا باستخدام الموائع الدقيقة للقطرات.

كما توضح التجارب المقدمة ، فإن استخدام منصات الموائع الدقيقة بالقطرات تقدم خصائص جذابة معينة مثل الإنتاجية العالية التي تسبب الحبس المثالي وقابلية التكاثر الأعلى. الكم الكبير من المعلومات المنتجة وأعلى سرعة يتم بها توليد هذه المعلومات. تطلبت اليورانيوم المنضب استخدام طرائق الكشف السريع بأعلى استبانة زمنية مكانية إذا كان من الممكن الحصول على الميزة الكاملة من هذه المنصات المصغرة.

في هذه الحالة ، نوضح أن هذا ممكن باستخدام تقنيات التحليل الطيفي الفلوري عالية الدقة.