التوليف ، والجمعية ، وتوصيف أحادي الطبقة المحمية الجسيمات النانوية الذهبية للأفلام كهربية البروتين أحادي الطبقة

الهدف العام من التجربة التالية هو تخليق جسيمات ذهب نانوية مثبتة بالألكيلات تُعرف باسم العناقيد المحمية بطبقة أحادية أو MPCs، وتجميع هذه المواد في تجمعات غشائية رقيقة تُستخدم كواجهة امتصاص للكيمياء الكهربائية لطبقة البروتين الأحادية من نوع azarin. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حماية غرويات الذهب بربيطات عضوية لإنشاء جسيمات ذهب نانوية محاطة بغشاء من Alcan Pholate. بعد ذلك، يتم تثبيت الـ MPCs على ركائز من الذهب والزجاج وربطها في أغشية رقيقة متعددة الطبقات مرتبطة تساهمياً، حيث يتم تتبع نموها عبر القياسات الضوئية والكهروكيميائية، بالإضافة إلى المجهر المقطعي.

بعد ذلك، يتم امتزاز بروتين نقل الإلكترونات azarin عند الواجهة، ويُجرى قياس الجهد الدوري (cyclic voltammetry) للكيمياء الكهربائية لطبقة البروتين أحادية الجزيئات. وتظهر النتائج أن واجهات أغشية MPC التي تم إنشاؤها بهذه الطريقة تسمح بتحليل كهركيميائي أكثر تحسيناً للبروتين الممتز بناءً على غشاء MPC، مما يوفر واجهة امتزاز أكثر تجانساً وحركية نقل إلكترونات سريعة تفتقر إلى الاعتماد التقليدي على المسافة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالكيمياء الكهربائية التقليدية للبروتينات في أن الأقطاب المعدلة بأغشية الجسيمات النانوية توفر واجهة امتزاز تؤدي إلى سلوك كهركيميائي أكثر مثالية كما تم قياسه بواسطة قياس الجهد الدوري.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن عملية التخليق تتضمن إشارات بصرية هامة، بينما تشتمل عملية بناء الفيلم وتوصيفه على عدة خطوات دقيقة وتقنيات تحليلية. يمكن تجميع أفلام NPC على أقطاب ذهبية معدلة أو شرائح زجاجية باستخدام طريقة دورة الغمس التي تعتمد على التناوب بين طبقات MPC وجزيئات الربط الثنائية. وبناءً على ذلك، يمكن تتبع هذه الطبقات كهروكيميائياً أو بصرياً حتى الوصول إلى سمك الفيلم المطلوب.

لتخليق عناقيد الذهب تحت غطاء سحب ذي تهوية مناسبة، ابدأ بإذابة 1.1 grams من بروميد رباعي أوكسو الأمونيوم في 30 milliliters من التولوين، وأذب 0.38 grams من بوروهيدريد الصوديوم في حوالي 20 milliliters من الماء فائق النقاء بقدرة 18 mega ohms، واتركه يبرد على الثلج لمدة 30 minutes على الأقل. بعد ذلك، انقل محلول رباعي كلورو هيدرات الذهب كمياً إلى محلول التولوين الذي يحتوي على بروميد رباعي أوكسو الأمونيوم باستخدام خمسة milliliters إضافية من الماء فائق النقاء. ومن أجل نقل محلول الذهب المائي إلى المحلول غير المائي عبر انتقال الطور، أغلق الوعاء بشكل خفيف ورجّه بقوة لمدة 30 minutes.

وبذلك يتم خلط الطورين المائي ذي اللون البرتقالي المحروق والطور غير المائي الشفاف جيداً. انقل كلا الطورين، المائي الشفاف وغير المائي ذي اللون البرتقالي المحروق، إلى قمع فصل. تخلص من الطبقة المائية وقم بصب الطبقة غير المائية في دورق نظيف.

أضف C six بنسبة اثنين إلى واحد إلى المحلول غير المائي الذي يحتوي على tetra chloro aurate الهيدروجينية. يتم التقليب لمدة 30 دقيقة لتكوين بوليمر الذهب (I)، وهو ما يُستدل عليه من تغير اللون من البرتقالي المائل للاحمرار إلى محلول أصفر شاحب شبه عديم اللون. انقل خليط التفاعل إلى حمام ثلجي معزول وبرده حتى 0 °C لمدة 30 دقيقة على الأقل مع التقليب، ثم أضف محلول borohydride الصوديوم المبرد كمياً وبسرعة إلى خليط التفاعل من أجل اختزال الذهب (I) إلى ذهب معدني في وجود thighs.

عند الإضافة، سيتشكل فوراً محلول أسود كثيف من عناقيد الذهب المحمية بطبقة أحادية (MPCs). قم بتحريك التفاعل طوال الليل عند درجة صفر مئوية، وفي اليوم التالي، انقل خليط التفاعل إلى قمع فصل.

تخلص من الطبقة المائية في دورق نفايات وجهاز التبخير الدوار. قم بتبخير طبقة التولوين غير المائية حتى تقترب من الجفاف التام، مما يترك حمأة سوداء ثقيلة في الدورق. رسب الـ MPCs عن طريق إضافة الأسيتونيتريل، واترك المحلول ليلة كاملة باستخدام مرشح زجاجي مسامي متوسط مع وصلات مطاطية ودورق ذي ذراع جانبية مع جهاز شفط.

اجمع المركبات المسامية المعدنية (MPCs) عن طريق الترشيح بالتفريغ واغسلها بكمية كبيرة من الأسيتونيتريل. بعد تجميع خلية الساندويتش كهروكيميائياً، قم بتنظيف الركيزة الذهبية عن طريق إجراء قياس الجهد الدوري أو CV في نوافذ جهد من 0.2 إلى 0.9 فولت، ومن 0.2 إلى 1.2 فولت، ومن 0.2 إلى 1.35 فولت بمعدل مسح 100 millivolts per second في محلول من حمض الكبريتيك بتركيز 0.1 molar وكلوريد البوتاسيوم بتركيز 0.01 molar. قم بقياس تيار شحن الطبقة المزدوجة للركيزة الذهبية العارية والمنظفة عن طريق إجراء CV في الظروف القياسية، والتي تتضمن نافذة جهد من 0.1 إلى 0.4 فولت مقابل silver cy chloride بمسح قدره 100 millivolts per second في محلول منظم من فوسفات البوتاسيوم أو KPB.

تخلص من المحلول المنظم واشطف الركيزة مرتين وبغزارة باستخدام الماء فائق النقاء والإيثانول. قم بتعريض ركيزة الذهب النظيفة إلى حوالي 300 µL من محلول C six بتركيز 5 mM في الإيثانول، واتركها طوال الليل لتشكيل طبقة C six SAM مرتبة. تخلص من محلول C six من الخلية واشطفها مرتين وبغزارة باستخدام الإيثانول والماء فائق النقاء.

قم بقياس تيار الشحن لطبقة أحادية الجزيئات (SAM) في الظروف القياسية. تخلص من محلول KPB واغسل القطب مرتين وبشكل مكثف باستخدام الماء عالي النقاوة والإيثانول. يجب أن ينخفض تيار الشحن بشكل ملحوظ.

بدءاً من قياسات الذهب العاري، قم بتعريض ركيزة الذهب المعدلة بطبقة SAM إلى حوالي 300 µL من محلول NDT بتركيز 5 mM في الإيثانول، واتركها لمدة ساعة واحدة لضمان تداخل جزيئات ربط NDT ضمن طبقة C six Sam. تخلص من محلول NDT واشطف الركيزة مرتين بشكل مكثف وشامل باستخدام الإيثانول والمياه فائقة النقاء، ثم مرة واحدة باستخدام diam methane. قم بتعريض ركيزة الذهب إلى محلول MPC في diam methane مع التقليب عن طريق تمرير غاز النيتروجين ببطء لمدة ساعة واحدة.

هذه هي طبقة MPC المثبتة لتجميع الغشاء. تخلص من محلول MPC واشطفها مجدداً بالتتابع باستخدام ثنائي كلورو ميثان، والماء فائق النقاء، وKPB. قم بقياس تيار الشحن لطبقة MPC في الظروف القياسية.

تخلص من KPB واغسل الركيزة جيداً بماء فائق النقاء و DIAM methane. عرّض ركيزة الذهب لحوالي 300 microliters من محلول NDT بتركيز خمسة millimolar في DIAM methane مع التقليب عن طريق فقعه ببطء بغاز النيتروجين لمدة 20 دقيقة. تخلص من NDT واغسل الركيزة جيداً باستخدام DIAM methane لترسيب طبقة MPC الثانية.

أعد غمر تجميعة الغشاء في محلول MPC الخاص بـ DIAM methane واتركها مع التقليب عن طريق فقاعة غاز النيتروجين ببطء لمدة ساعة واحدة قبل الشطف. بعد ذلك، قم بقياس تيار الشحن لطبقة MPC مرة أخرى في الظروف القياسية، ثم اشطفها مجدداً باستخدام نفس الإجراء. يمكن ترسيب طبقات MPC إضافية إذا لزم الأمر.

بعد اكتمال غشاء MPC الشبكي، اشطف الركيزة المعدلة بالغشاء باستخدام KPB لامتزاز بروتين AZ على تجمع غشاء MPC. احقن حوالي 150 µL من محلول AZ بتركيز يتراوح بين 5 إلى 10 µM في KPB داخل خلية sandwich الكيميائية الكهربائية، واتركها مغطاة ومبردة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد عودة خلية ECM إلى درجة حرارة الغرفة، اشطفها جيداً باستخدام KPB، ثم أعد ملء خلية ECM بـ KPB وقم بتمرير غاز النيتروجين في KPB لمدة 10 دقائق.

قم بإجراء دراسات كهركيميائية أحادية الطبقة مثل فولتاميتريا الجهد الدوري (CV) في نافذة جهد تتراوح من -0.25 فولت إلى 0.25 فولت. يتم المسح بمعدل 100 ميلي فولت في الثانية في محلول KPB Rinse A باستخدام شريحة زجاجية معدلة بـ 3M PT MS مع DIAM methane، ثم ضعها في محلول MPC من DIAM methane لمدة ساعة واحدة مع التقليب على هزاز بسرعة منخفضة. يكمل هذا تكوين طبقة MPC الأولى من تجميع الفيلم عن طريق تثبيت MPCs في مجموعات ME captan الطرفية للـ sane.

اشطف الشريحة جيداً باستخدام Dior methane، وجففها باستخدام غاز النيتروجين، ثم خذ طيف UV vis للشريحة بعد نقعها في محلول NDT في diam methane. ضع الشريحة في محلول MPC لمدة ساعة واحدة مع التقليب على جهاز هزاز بسرعة منخفضة. وبهذا تكتمل طبقة MPC الثانية من تجميع الفيلم.

اشطف الشريحة جيداً باستخدام DIAM ميثان، وجففها بغاز النيتروجين، ثم التقط طيف UV vis للشريحة. يجب أن تزداد الامتصاصية عبر الطيف مع امتصاص طبقات MPC إضافية في تجمُّع الغشاء. لإرفاق غشاء MPC مُجمَّع على شريحة زجاجية معدلة بـ 3M PT MS على شريحة مجهر قياسية.

قم بتحضير راتنج الإيبوكسي embed eight 12 واتركه يتكثف لمدة 12 ساعة على الأقل. املأ كبسولة شعاعية براتنج الإيبوكسي واقلبها فوق عينة غشاء MPC. ضع ضغطاً على الكبسولة بحيث ترتفع فقاعة إلى أعلى الكبسولة، مما يؤدي إلى تكوين سدادة بين راتنج الإيبوكسي وعينة غشاء MPC.

اتركه ليتـبلمر لمدة 18 ساعة على الأقل عند 60 °C ثم برد الشرائح المثبتة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. سخّن الشرائح المثبتة لمدة 20 ثانية على لوح تسخين من الألومنيوم المصبوب عند 200 °C لتسهيل إزالة القالب مع MPC الملتصق على الفيلم السريع. اقطع العينة التي تحتوي على الفيلم من قالب كبسولة الشعاع باستخدام منشار المجوهرات، ثم ضع الجزء المزال في قالب سيليكون مسطح مع توجيه جانب فيلم MPC للأعلى مواجهاً للجزء الداخلي من السيليكون.

املأ البئر السيليكوني براتنج الإيبوكسي في درجة حرارة الغرفة واتركه ليتبلمر لمدة 18 ساعة على الأقل عند 60 درجة مئوية. ثم اترك العينة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. قم بقص مقاطع رقيقة من العينة يتراوح سمكها من 60 إلى 80 نانومتر باستخدام جهاز الميكروتوم الفائق Leica UCT، مع استخدام سكين ماسية لقص المقاطع بشكل عمودي على حافة السكين، ثم ضع المقاطع المقطوعة على غشاء دعم كربوني Formvar على شبكات نحاسية ذات 400 مش، والتقط صور TEM للمقاطع العرضية لتجميعات غشاء MPC الموضحة.

فيما يلي نتائج مراقبة تيار شحن الطبقة المزدوجة لنمو فيلم MPC بإجمالي خمس دورات غمس تتضمن التعرض بالتناوب لمحاليل MPC وNDT. تزداد تيارات الشحن بشكل منهجي مع كل دورة غمس، مما يشير إلى إضافة طبقات من MPC إلى الفيلم.

يوضح الشكل التالي مخطط فولتاميتري حلقي نموذجي لـ AZ add absorb في تجميعة غشاء MPC، تم جمعه باستخدام نافذة جهد من -0.25 إلى +0.25 فولت بمسح قدره 100 millivolts في الثانية في محلول منظم من فوسفات البوتاسيوم بتركيز 4.4 millimolar. كما يظهر هنا رصد طيفي ممثل بالأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV vis) لنمو غشاء MPC مرتبط بـ diol على شريحة زجاجية معدلة بـ 3M PT MS. وتتكون دورة الغمس من تعريض الشريحة الزجاجية لمحلول رابط NDT، يليه التعريض لمحلول MPC.

تؤدي كل عملية غمر لاحقة إلى زيادة في سمك الغشاء وزيادة متزامنة في الامتصاصية. يوضح هذا الشكل تحليل صورة مقطعية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ لتجميع غشاء MPC مرتبط بـ DIA. ويظهر الشكل المدرج صورة TEM نموذجية لـ MPCs الوظيفية بـ hexa methol المستخدمة في تحليل TEM لتجميع الغشاء.

باستخدام برنامج Image J، تم تحديد متوسط قطر النواة الذهبية للجسيمات النانوية المركبة (MPCs) ليكون حوالي 2 نانومتر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تصنيع وتوصيف وتجميع أغشية رقيقة من MPCs الذهبية التي تعمل كواجهة لامتزاز والتحليل الكهركيميائي اللاحق لبروتينات الأكسدة والاختزال. إن عملية تجميع الغشاء قابلة للتكيف بسهولة من خلال التحكم في إجراء تصنيع MPCs وكذلك آلية ربط الجسيمات الداخلية لتلائم امتزاز مجموعة متنوعة من البروتينات.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول الكيمياء الكهربائية لامتصاص البروتين في المنصات الاصطناعية المعدلة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في تطوير أنظمة نمذجة نقل الإلكترون، ومخططات الاستشعار الحيوي، والمواد الاصطناعية المتوافقة حيوياً.