الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار
January 23rd, 2012
والانشطار الخميرة ، Schizosaccharomyces pombe ، هو نظام نموذجا جيدا لدراسة العمليات الخلوية الأساسية. نحن هنا وصف طريقة التحليل الكمي لأداء الخلية الحية من الخميرة الانشطار. في هذه التجربة خاصة ونحن نركز على تنظيم الجينوم داخل نواة الخلية ، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لدراسة العوامل عصاري خلوي.
الهدف العام من التجربة التالية هو قياس التنظيم النووي الفرعي في خلايا الخميرة كميا وكيف تتأثر بالتغيرات في ظروف النمو أو الطفرات. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة خلايا الخميرة لمرحلة التسجيل في ظروف من شأنها تقليل التألق الذاتي. بعد ذلك ، يتم وضع الخلايا في غرفة نمو لعرضها تحت المجهر.
ثم يتم التقاط الصور لقياس المسافة بين الهياكل المختلفة ذات العلامات الفلورية في الخلية. تم الحصول على النتائج التي تظهر اختلافات في التنظيم غير النووي ، والذي يعتمد على تغيير الظروف الغذائية أثناء نمو ثقافة الخميرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال epie حول التفاعل بين تنظيم السوبار أو تنظيم الكروماتين والجينات.
تبدأ أسماك تول والخميرة بإعداد متوسط إدنبرة الأدنى أو EMM و EMM أيضا بكلوريد الأمونيوم لتقليل التألق الذاتي بدلا من الأوتوكلاف. استخدم مرشح 0.2 ميكرون لتعقيم محلول الجلوكوز وإضافته إلى وسائط الأوتوكلاف. تلقيح ثلاثة ملليلتر من EMM في أنابيب سعة 30 ملليلتر بخلايا الأسماك والخميرة.
نمت YEA حديثا على طبق أجار في الوسط الغني ، وهي تغطي الأنابيب برفق وتحتضن الخلايا في شاكر عند 225 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية. احتفظ بالخلايا في مرحلة السجل لمدة يومين عن طريق عدها بغرفة بيركا كل صباح ومساء وتخفيفها إلى الكثافة المناسبة. في يوم التجربة.
يجب أن تكون الخلايا مرحلة تسجيل مبكرة لطاقم النيتروجين. تشير الخلايا إلى الإجراء الموضح في البروتوكول المكتوب لجمع الخلايا في حبيبات واحدة في الجزء السفلي من جهاز الطرد المركزي الأنبوبي ، و 1.5 مل من الخلايا في أنبوب orph بحد أقصى 1.5 RCF عن طريق تدوير الأنبوب أولا لمدة دقيقتين ، ثم قلبه 180 درجة لدوران دقيقتين إضافيتين. قم بإزالة جميع المواد الطافية باستثناء 10 إلى 15 ميكرولترا وأعد تعليق الخلايا في الوسط المتبقي ، مع كمية واحدة من ملليغرام لكل مليلتر من الليكتين المعقم بالفلتر.
أضف خمسة ميكرولترات من محلول الليكتين إلى زاوية زجاج الغطاء وأضف خمسة ميكرولترات من الثقافة إلى قطرة الليكتين. لإنشاء غرفة نمو من الخلايا الأساسية S pom ، قم بتدوير خمسة ميكرولترات من EMM على شريحة نظيفة وقم بقلب زجاج الغطاء بالمزرعة بزاوية 70 درجة فوق الوسط وقم بإسقاطه من أعلى لأسفل على EMM لإغلاق الحواف بشحم السيليكون. قم بقص الطرف العريض لطرف سعة 200 ميكرولتر وقم بتوصيل الطرف الضيق بحقنة ملليلتر.
املأ المحقنة بحوالي ملليلتر واحد من شحم السيليكون. ضع خطا رفيعا من السيليكون على حواف زجاج الغطاء عن طريق دفع مكبس المحقنة برفق لتصوير غرفة النمو. ابدأ باستخدام Brightfield Imaging لتحديد موقع الخلايا والحفر.
احصل على صورة واضحة للفحص المجهري متحد البؤر. نحن نستخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر Zeiss LSM 700 مع كرومات مخطط 63 مرة من العدسة الموضوعية الزيتية ، وإعداد مسح مستوي متوسط 16 سطرا. اضبط وحدات المنطقة على واحد إلى 1.1 للحصول على شريحة بصرية من 0.8 ميكرون.
افحص الخلايا باستخدام الليزر الذي يكتشف Alexa 4 88 و mCherry أو GFP. سجل صورا كافية لأخذ القياسات في 60 خلية لكل تصريف. قم بالتبديل إلى غرفة نمو جديدة بخلايا جديدة.
بعد 60 دقيقة من التصوير ، افتح صورة في برنامج Zeen Light Edition لقياس المسافة بين إشارات الفلوروفورات المختلفة في نفس المستوى البؤري. افتح أداة القياسات واضبط شدة الضوء والتباين لتحديد مركز كل إشارة فلورية ، على سبيل المثال ، جسم عمود المغزل والغشاء النووي ، وقياس المسافة بينهما. انقل البيانات إلى ورقة المفكرة.
قارن متوسط أو متوسط المسافات تحت الخلوية بين السلالات والعلاجات المختلفة باستخدام البرامج الإحصائية أو الاختبارات مثل اختبار T أو اختبار مجموع رتبة مان ويتني. في سلالة المثال هذه ، تمت زراعة PJ 1 18 5 في EMM وتم وضع عينة في غرفة النمو للتصوير. ثم اقتباس PJ 1 18 5.
تم نقل الثقافة إلى EMMN واحتضانها لمدة 15 دقيقة قبل وضع العينة في غرفة النمو للتصوير. تم استخدام أداة القياس لقياس المسافة بين الموضع وجسم عمود المغزل وكذلك بين الموضع والغشاء النووي. كما هو موضح هنا ، كان هناك اختلاف ذي دلالة إحصائية في مسافة مجموعة الجينات التي تتحرك بعيدا عن الغشاء النووي باتجاه جسم قطب المغزل في الخلايا المتعطشة للنيتروجين مقارنة بالخلايا المزروعة في النيتروجين.
كان للبيانات التي تقيس المسافة بين GFP و SBP توزيع طبيعي ، وبالتالي يمكن مقارنة متوسط المسافات باستخدام اختبار T. كان هناك فرق كبير بين القيمتين المتوسطتين. لم يكن للبيانات التي تقيس المسافة بين GFP و NM توزيع طبيعي ، وبالتالي تمت مقارنة المسافات المتوسطة باستخدام اختبار المجموع المصنف لرجل ويتني.
كان هناك فرق كبير بين القيمتين المتوسطتين بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية ارتباط مستوى التعبير الجيني بالتغيرات في التنظيم النووي الفرعي.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة للتحليل الكمي للخلايا الحية من الخميرة الانشطارية، Schizosaccharomyces pombe، مع التركيز على تنظيم الجينوم داخل نواة الخلية. تتيح الطريقة للباحثين التحقيق في كيفية تأثير تنظيم تحت النووي على ظروف النمو والطفرات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم الوراثة
- علم الأحياء الدقيقة
الخلفية
- Schizosaccharomyces pombe بمثابة كائن نموذجي لدراسة العمليات الخلوية.
- فهم تنظيم الجينوم ضروري للحصول على رؤى حول تنظيم الجينات.
- تقنيات تصوير الخلايا الحية يمكن أن تكشف عن الهياكل الخلوية الديناميكية.
- يمكن أن تؤثر التغييرات في ظروف النمو على التنظيم الخلوي.
غرض الدراسة
- قياس التنظيم تحت النووي في خلايا الخميرة بشكل كمي.
- لتقييم تأثير الظروف الغذائية والطفرات على تنظيم الجينوم.
- توفير طريقة لدراسة ديناميكيات الكروماتين وتنظيم الجينات.
الطرق المستخدمة
- تزرع خلايا الخميرة في وسط بسيط إلى المرحلة الأسية.
- تحضر الخلايا للتصوير باستخدام غرفة نمو والمجهر المقطعي.
- يتم تصوير الهياكل الموسومة بالفلورسنت لقياس المسافات بينها.
- يتم إجراء تحليل إحصائي لمقارنة المسافات في ظل ظروف مختلفة.
النتائج الرئيسية
- لوحظت اختلافات كبيرة في التنظيم تحت النووي في ظل ظروف نمو مختلفة.
- أظهرت قياسات المسافات بين الإشارات الفلورسنتية تغيرات في تحديد موقع الكروماتين.
- أكدت الاختبارات الإحصائية على أهمية الاختلافات التي لوحظت.
- توفر الطريقة رؤى حول العلاقة بين التنظيم تحت النووي والتعبير الجيني.
الاستنتاجات
- الطريقة المطورة فعالة لدراسة تنظيم الجينوم في الخميرة الانشطارية.
- تسلط النتائج الضوء على تأثير العوامل البيئية على ديناميكيات الكروماتين.
- يمكن تطبيق هذه النهج لدراسة آليات تنظيم الجينات بشكل أكبر.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative live cell fluorescence microscopy in fission yeast enables precise measurement of subnuclear organization and its dynamic response to environmental changes. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses about chromatin architecture and gene regulation. The method supports predictive confidence in target validation and informs portfolio decisions at the intersection of cell biology and functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin organization and its impact on gene regulation under defined conditions.
- Supports functional target validation by quantifying spatial genome dynamics in response to perturbations.
- Provides mechanistic de-risking for hypotheses linking nuclear architecture to gene expression changes.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell imaging systems for reproducible measurement of subcellular distances.
- Facilitates assay standardization through quantitative, statistically analyzable outputs.
- Enables screening of genetic or environmental modifiers affecting nuclear organization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subnuclear localization changes with gene induction events relevant to disease models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking chromatin dynamics to functional readouts.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker development when chromatin positioning is implicated.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative imaging method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on chromatin organization and gene regulation relationships.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing genetic or environmental conditions.
- Analytics: Delivers statistically robust measurements (mean, median distances) for cross-condition analysis.
- Translational Research: Connects nuclear architecture changes to gene induction relevant for disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for live cell imaging and quantitative analysis across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows and ensures reproducibility of quantitative outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust data on chromatin dynamics and gene expression relationships.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and pathways based on quantitative nuclear organization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical software for distance measurements.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and statistical analysis methods.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or model systems with varying genetic backgrounds.
- Practical limitations include autofluorescence management and ensuring sufficient sample size for statistical power.
