الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

الهدف العام من التجربة التالية هو القياس الكمي للتنظيم دون النووي في خلايا الخميرة ومدى تأثره بالتغيرات في ظروف النمو أو الطفرات. ويتم تحقيق ذلك من خلال تنمية خلايا الخميرة حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي في ظروف تقلل من التألق الذاتي. بعد ذلك، توضع الخلايا في غرفة نمو للفحص تحت المجهر.

بعد ذلك، يتم التقاط الصور لقياس المسافة بين الهياكل المختلفة الموّسمة فلورياً في الخلية. وتُستخلص نتائج تظهر اختلافات في التنظيم غير النووي، والذي يعتمد على تغيير الظروف الغذائية أثناء نمو مزرعة الخميرة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الوراثة فوق الجينية حول التفاعل بين التنظيم تحت النووي للكروماتين والتنظيم الجيني.

يبدأ العمل على أسماك Toul والخميرة بتحضير وسط إدنبرة الأدنى (Edinburgh minimal medium) أو EMM، ووسط EMM مع إضافة كلوريد الأمونيوم لتقليل الفلورة الذاتية بدلاً من التعقيم بالموصدة. استخدم مرشحاً بمسامية 0.2 ميكرون لتعقيم محلول الجلوكوز ثم أضفه إلى الأوساط التي تم تعقيمها بالموصدة. قم بتلقيح 3 مل من وسط EMM في أنابيب سعة 30 مل باستخدام خلايا الأسماك والخميرة.

بعد تنميتها حديثاً على طبق أغار في الوسط الغني YEA، قم بتغطية الأنابيب بشكل خفيف وحضن الخلايا في هزاز بسرعة 225 RPM وعند درجة حرارة 30 degrees Celsius. حافظ على الخلايا في طور النمو اللوغاريتمي لمدة يومين من خلال عدها باستخدام غرفة بيركا كل صباح ومساء وتخفيفها للوصول إلى الكثافة المناسبة. في يوم التجربة.

يجب أن تكون الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي المبكر عند إضافة النيتروجين. تشير الخلايا إلى الإجراء الموضح في البروتوكول المكتوب لجمع الخلايا في كريّة واحدة في قاع أنبوب طرد مركزي، حيث يتم وضع 1.5 milliliters من الخلايا في أنبوب eend orph وبقوة طرد مركزي نسبية قصوى تبلغ 1.5 RCF، وذلك عن طريق تدوير الأنبوب أولاً لمدة دقيقتين، ثم تدويره بزاوية 180 درجة لعملية تدوير إضافية لمدة دقيقتين. يتم إزالة جميع السوائل الطافية باستثناء 10 إلى 15 µL، ثم يتم إعادة تعليق الخلايا في الوسط المتبقي، ثم تُضاف عينة بتركيز 1 mg/mL من الليكتين المعقم بالترشيح.

أضف خمسة 5 µL من محلول اللكتين إلى زاوية غطاء الشريحة، ثم أضف خمسة 5 µL من المزرعة إلى قطرة اللكتين. ولإنشاء غرفة نمو لخلايا S pom القاعدية، انقل خمسة 5 µL من وسط EMM بواسطة الماصة إلى شريحة نظيفة، ثم اقلب غطاء الشريحة الذي يحتوي على المزرعة بزاوية 70 درجة فوق الوسط، وأنزله عمودياً على وسط EMM لإغلاق الحواف باستخدام الشحم السيليكوني. اقطع الطرف العريض لرأس ماصة سعة 200 µL وثبّت الطرف الضيق في حقنة سعة 2 mL.

املأ المحقنة بنحو 1 مل من شحم السيليكون. ضع خطاً رفيعاً من السيليكون على حواف غطاء الشريحة الزجاجية عن طريق دفع مكبس المحقنة برفق لتثبيت غرفة النمو. ابدأ باستخدام التصوير بالمجال المضيء (Brightfield Imaging) لتحديد موقع الخلايا والبدء في الحفر.

احصل على صورة حادة للمجهر البؤري (confocal microscopy). نستخدم مجهر Zeiss LSM 700 الماسح بالليزر مع عدسة شيئية زيتية plan apoch chromat بقوة تكبير 63x، وإعداد مسح مستوٍ بمتوسط 16 خطاً. اضبط وحدات المنطقة من 1 إلى 1.1 للحصول على شريحة بصرية بسمك 0.8 microns.

امسح الخلايا باستخدام الليزرات التي تكتشف Alexa 4 88 و mCherry أو GFP. سجل عددًا كافيًا من الصور لإجراء القياسات في 60 خلية لكل مَصرف. انتقل إلى غرفة نمو جديدة تحتوي على خلايا حديثة.

بعد 60 دقيقة من التصوير، افتح صورة في برنامج Zeen Light Edition لقياس المسافة بين إشارات الفلوروفورات المختلفة في نفس المستوى البؤري. افتح أداة القياسات واضبط شدة الإضاءة والتباين لتحديد مركز كل إشارة فلورية، على سبيل المثال، جسم القطب المغزلي والغشاء النووي، ثم قم بقياس المسافة بينهما. انقل البيانات إلى ورقة ملاحظات.

قارن متوسط أو وسيط المسافات تحت الخلوية بين السلالات والمعالجات المختلفة باستخدام برامج أو اختبارات إحصائية مثل اختبار T-test أو اختبار مان-ويتني لمجموع الرتب (Mann Whitney Rank sum test). في هذه السلالة كمثال، تم استنبات PJ 1 18 5 في وسط EMM ووضعت عينة في غرفة نمو للتصوير. ثم تم أخذ جزء من PJ 1 18 5.

نُقلت المزرعة إلى وسط EMMN وحُضنت لمدة 15 دقيقة قبل وضع عينة في غرفة نمو للتصوير. استُخدمت أداة القياس لتحديد المسافة بين الموقع وجسم قطب المغزل، وكذلك بين الموقع والغشاء النووي. وكما هو موضح هنا، كان هناك فرق ذو دلالة إحصائية في مسافة ابتعاد التجمع الجيني عن الغشاء النووي باتجاه جسم قطب المغزل في الخلايا التي تعاني من نقص النيتروجين مقارنة بالخلايا التي نمت في وجود النيتروجين.

أظهرت البيانات التي تقيس المسافة بين GFP و SBP توزيعاً طبيعياً، وبناءً على ذلك، تمت مقارنة متوسطات المسافات باستخدام اختبار T-test. وقد تبين وجود فرق معنوي بين قيمتي المتوسطين. أما البيانات التي تقيس المسافة بين GFP و NM فلم تكن ذات توزيع طبيعي، ولذلك تمت مقارنة وسيطات المسافات باستخدام اختبار مان ويتني للمجموع الرتبي (Mann-Whitney ranked sum test).

كان هناك فرق ملحوظ بين القيمتين الوسيطتين بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR)، للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية ارتباط مستوى التعبير الجيني بالتغيرات في التنظيم تحت النووي.