وكشف ونشر استنساخ المعدية الجزيئية لفيروس ميثة-فيزنا أن تعرب عن بروتين الفلورية الخضراء

الهدف العام من هذا الإجراء هو إكثار والكشف عن استنساخ مُعدٍ من فيروس Mildy مقابل عدم وجود فيروس، والذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر. وقد تم استنساخ هذا البروتين الفلوري الأخضر في الجين المشفر لـ D utp Ace في جينوم فيروس Myy Ner.

يحتوي المستنسخ المعدي على بلازميدين. أولاً، يتم قطع البلازميدين اللذين يحملان تسلسلات myy Ner باستخدام إنزيم القطع xpa one ثم يتم ربطهما. ثانياً، يتم ترانسفكشن خلايا الضفيرة المشيمية للأغنام باستخدام هذا التركيب.

أخيراً، يتم الكشف عن الخلايا المصابة بفيروس myy vino باستخدام المجهر الفلوري وقياس التدفق الخلوي. مرحباً، أنا ستيفانو نيرون من معهد TER للمسارات المرضية التجريبية في جامعة أيسلندا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإكثار والكشف عن مستنسخ جزيئي معدٍ لفيروس my vascular الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر.

يتم احتواء المستنسخ الجزيئي في البلازميدات P8XSP5EGFP و P67OR بحجم 12 kilobases و 4.5 kilobases على التوالي. قم بقطع كميات متساوية المولارية من البلازميدين، وهي 4.4 µg من P8XSP5EGFP و 1.6 µg من P67OR باستخدام XPA1 ثم قم بإجراء الربط قبل عملية التحول. عند اكتمال الربط، قم بحضن خليط الربط عند 65 °C لمدة 15 دقيقة. قبل يومين من عملية التحول، قم بزراعة 10⁶ من خلايا SCP في قارورة زراعة أنسجة T25 واترك الخلايا تنمو لمدة يومين في 5 mL من وسط DMEM مضاف إليه 10% lamb serum و 2 mM glutamine بدون مضادات حيوية حتى تصل إلى طبقة أحادية بنسبة 90% confluence.

إذا لم تصل الخلايا إلى 90%CO بعد يومين، فاترك الخلايا لتنمو ليوم إضافي واحد. يمكن استبدال مصل الحمل بمصل جنين البقر FBS. نحن نستخدم مصل الحمل بشكل روتيني لأن بعض سلالات MVV يتم تثبيطها بواسطة FBS.

ومع ذلك، فإن سلالة MVV هذه لا تتقيد بـ FBS. عندما تصبح الخلايا جاهزة لعملية عفن الجينات (transfection)، يتم تغيير الوسط إلى DMEM مع 1% مصل أغنام أو FBS بدون مضادات حيوية. نستخدم Lipofectamine 2000 لعملية عفن الجينات، حيث يتم تخفيف DNA في 500 microliters من وسط opti MEM، وتخفيف 20 microliters من lipofectamine 2000 في 500 microliters من وسط opti MEM، ويترك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد فترة تحضين لمدة خمس دقائق، اخلط الحمض النووي DNA المخفف مع lipofectamine 2000 المخفف ليكون الحجم الإجمالي 1000 µL. اخلط المزيج بلطف واتركه للتحضين لمدة 20-30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة، أضف خليط ترانسفكشن (transfection mix) إلى دورق T 25 الذي يحتوي على خلايا SCP والوسط الغذائي مع التحريك بلطف.

تحضين في درجة حرارة 37 °C و 5% carbon dioxide طوال الليل. يتم تغيير الوسط في اليوم التالي إلى DMEM يحتوي على 1% serum و 2 mM glutamine و 100 IU/mL penicillin و 100 IU/mL streptomycin. تتم مراقبة إنتاج GFP في خلايا SCP باستخدام المجهر الفلوري المقلوب.

يمكن توقع انخفاض كفاءة عفن التحول في هذه الخلايا الأولية، والتي تتراوح عادةً بين 5% و15%. استمر في التحضين عند 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون لعدة أيام للسماح بانتشار الفيروس في القارورة. يستغرق الأمر عادةً من 7 إلى 14 يوماً لحدوث العدوى الكاملة. قم بحصد الفيروس عن طريق نقل السائل الطافي إلى أنابيب إبندورف.

قم بالتدوير في جهاز طرد مركزي دقيق عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق لإزالة حطام الخلايا. ثم انقل الطافي الذي يحتوي على الفيروس إلى أنابيب جديدة.

قم بتخزين 3×10⁴ من خلايا SCP عند درجة حرارة 80- °C، ثم ازرعها في 100 µL من وسط DMEM المكمل بـ 10% سيروم، و 2 mM جلوتامين، و 100 IU/mL بنسلين، و 100 IU/mL ستريبتومايسين لكل بئر.

في طبق يحتوي على 96 بئراً، يتم التحضين عند 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون. إذا كانت الخلايا متلاحمة في اليوم التالي، يتم تغيير الوسط إلى DMEM مع 1% مصل. مع وضع 100 µL في كل بئر، يتم تخفيف الفيروس بالطريقة التالية.

أضف 180 µL من وسط DMEM مع 1% مصل لكل بئر في أربعة مجموعات من 10 آبار في طبق ذو 96 بئر بقاع مستدير أو بقاع على شكل حرف V، وذلك لإجراء تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف في أربعة مكررات. أضف 20 µL من الفيروس إلى كل بئر من الآبار الأربعة في العمود الأول من الطبق. وباستخدام ماصة رباعية القنوات، قم بسحب السائل ودفعه للأعلى والأسفل لضمان خلط العينات جيداً.

قم بتغيير رؤوس الماصة وانقل 20 µL إلى الآبار الأربعة التالية وهكذا. اترك الآبار الأخيرة بدون فيروس لتكون بمثابة ضابط سلبي. أضف 100 µL من تخفيف الفيروس إلى خلايا SEP والحاضنة الوسطية.

درجة حرارة 37 °C و5% من ثاني أكسيد الكربون. يتم الرصد للكشف عن فلورة GFP والتأثيرات المرضية الخلوية لمدة أسبوعين. وتتمثل التأثيرات المرضية الخلوية في تحول الخلايا إلى الشكل المستدير وتصبح أقل شفافية من الخلايا الطبيعية مع تمدد الزوائد الخلوية، وتنتهي بظهور خلايا متعددة النواة وموت الخلايا.

احسب عيار الفيروس باستخدام طريقة Reid Munch للمراقبة السريعة لتكاثر الفيروس. يمكن فحص الخلايا المصابة عن طريق قياس التدفق الخلوي لإنزيم التريبسين. تظهر حوالي 10⁵ من الخلايا المصابة.

اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وأعد التعليق في 500 µL من PBS، ثم أضف 500 µL من محلول Para formaldehyde بتركيز 4% للوصول إلى تركيز نهائي 2%، مع التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بترسيب الخلايا عند 3000 ×g لمدة خمس دقائق.

يُغسل بمحلول PBS مرتين لمدة خمس دقائق، ثم يُحلل باستخدام محلل fact scan. يتم حساب 10,000 حدث. يمكن أن يكون المستنسخ الجزيئي المعبر عن GFP للفيروس المقدم هنا مفيداً في تحليل التفاعلات بين الفيروس والمضيف والقدرة الإمراضية للفيروس العصبي الخاص بي، سواء في الجسم الحي (in vivo) أو في المختبر (in vitro).

على الرغم من أنه لم يتم إثبات قدرة الفيروس العصبي الخاص بي على التأثير في الخلايا البشرية، إلا أنه من المهم مراعاة جميع احتياطات مستوى السلامة البيولوجية؛ حيث يمكن الحصول على كل من الخلايا والبلازميد من مختبرنا. حظاً موفقاً في تجاربكم.