Name: إعداد أقراص سليمة الذيل البقري الفقرية للثقافة الجهاز (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: تعلم تقنية حصاد أقراص العمود الفقري البقري السليمة للثقافة الجهازية باستخدام أدوات قطع مخصصة ونظام غسيل ضغطي. تتيح هذه الطريقة للباحثين دراسة ميكانيكا الأقراص والأحمال الميكانيكية المعقدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد أيد هذا المشروع من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (SNF 310030-127586/1 #).

1. حصاد القرص الفقرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحصول على كامل طول ذيل الأبقار من مسلخ المحلية ، إذا كان ذلك ممكنا من دون وجود منذ الجلد من الجلد يزيد من فرصة للتلوث (الشكل رقم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعداد كبيرة لوح التقطيع والتحضير المعقمة محطة العمل والأدوات في أعلى لوحة القطع (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مبلل تحت شاش معقم غطاء تدفق الصفحي العقيمة مع كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ تحتوي على 55mM سترات الصوديوم ووضعها في كل بئر من لوحة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حوض وتمييع الحل 1:100 Betadine مع مياه الحنفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الذيل كله الأبقار في حوض يحتوي على 1 ٪ حل Betadine لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الذيل الجافة لفترة وجيزة مع شاش معقم ووضعه على محطة العمل العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية العضلات حول الذيل مع شفرة مشرط رقم 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم بعيدا أجزاء من الذيل والتي لا حاجة ، وعادة طرفي الذيل ، والتي تحتوي كبيرة نسبيا وصغيرة جداIVDs (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم مزيد من العضلات والأوتار حول IVD باستخدام شفرة مشرط رقم 10. حذار لا لقطع الحلقة الخارجية للأقراص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة الأمامي من IVD مع علامة الجلد الجراحية (هذه الخطوة اختيارية ، فإنه يساعد على تحديد مركز الدوران المحوري في مفاعل حيوي لدينا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد فقرة وIVD نقطة اتصال عن طريق تحريك الذيل برفق. يشعر الحدود بين IVD والعظام مع الجانب مملة من شفرة المشرط. وينبغي أن يكون في موقع الشق 1-2 ملم بعيدا من IVD نحو فقرة. أدلى مكان مخصص الصناعية حامل شفرة على موقع الشق (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلتصق IVD فقرة التي يدق على رأس حامل شفرة مصنوعة خصيصا الصناعية (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر على الجانب الآخر من الاتصال IVD - فقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعزولة التفاف IVD بشاش معقم مبلل مع كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ تحتوي على 55mM سترات الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة عزل IVDs لعدد العينة المطلوب (عادة حوالي 6 يمكنيمكن حصادها مع القطر بين 10-20 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل نظام غسيل الطائرات (زيمر ، المؤتمر الوطني العراقي.) مع الحل رينغر Lactated العقيمة ، و5L الحقائب هي الحجم مفيدة (PBS العقيمة بدلا من محلول ملحي أو 0.9 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد IVD مع ملقط غسيل والنفاثة كلا الجانبين من سطح endplate باستخدام زيمر Pulsavac النفاثة نظام غسيل (الشكل 1C). وينبغي أن أطلقوا النار على طائرة بندقية على سطح endplate بزاوية بين 30 -- 60 درجة لمدة 30S على كل جانب. (الشكلان 1 و 7) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع IVDs إلى لوحة 6 جيدا والتفاف مع شاش مبلل أثناء الغسيل طائرة عينة أخرى القرص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IVDs مستعدون للثقافة وأسفل الجهاز دفق التطبيقات (على سبيل المثال بقاء الخلية ، وتحميل الميكانيكية والثقافة الجهاز) (الشكل 1D). </li></ol> 2. ممثل النتائج ويمكن قياس نتائج ناجحة للحكم على إعداد القرص الفقرية تكون التجربة حيث نشر صغيرة الوزن الجزيئي صبغة الفلورسنت (مثل أحمر procion)مستعد كحل 1 ٪ في برنامج تلفزيوني 2. ثم يتم الاحتفاظ IVD مع ما لا يقل عن 100 مل من محلول الصبغة ، ويسمح بعد ذلك لنزع فتيل صبغة سلبية في IVD عن تورم تحت 24H الحرة. وIVD ومن ثم فلاش مجمدة في النيتروجين السائل واعادته الى درجة حرارة الغرفة والمجففة من خلال سلسلة من التحويلات الأسيتون (أول ما قبل تبريده في -80 درجة مئوية ، ثم -20 درجة مئوية ، ثم 4 درجات مئوية ، وأخيرا إلى درجة حرارة الغرفة ). ثم يمكن أن يكون جزءا لا يتجزأ من القرص في بولي ميثيل اكريليت (PMMA) وقطع مع شفرة حادة لانتاج 100 ميكرون سميكة المقاطع. ويمكن بعد ذلك أن ينظر إلى هذه المقاطع من قبل أي المجهر brightfield القياسية ولكن تفضيلي بواسطة استخدام المجهر مضان منذ procion الحمراء تنبعث مضان أحمر (الشكلان 5-6). وtrabeculi السطح العظمي تظهر نظيفة جدا بعد خطوة lavaging طائرة (الشكل 7). المعلمات من أجل ثقافة الجهاز الناجحة هي الأولى من غياب كل من وتلوث بقاء الخلية حافظ (الشكلان 8-9) ، وارتفاع القرصعموما "وحدة القرص" ، ويقاس مع المقاطع النسيجية وsafranin O / أخضر سريع وصمة عار أو Hematoxilin ماير 3. طورنا بروتوكولات وحدات الماكرو نشرت 4،5 في أماكن أخرى لصبغ الأنسجة الحية لفحص القرص وبقاء الخلية في 3d باستخدام مجهر المسح الضوئي والليزر مبائر عدة تلطيخ العيش / الميت (المسابر الجزيئية ، Invitrogen ، بازل ، سويسرا). علينا مواصلة تطوير ماكرو وروتينية لأداء الخلية الفرز الآلي لتقدير جدوى الخلية في النسيج 3D أو الناقلين 3D باستخدام منصة ImageJ المعاهد الوطنية للصحة و 4-6. وقد اقترحت بروتوكولات بديلة لتحديد الجدوى خلية من خلايا القرص بواسطة الهضم الأولية باستخدام الهضم متتابعة من المصفوفة خارج الخلية باستخدام pronase كولاجيناز واكتب 2 ثم إلى وصمة عار على تعليق الخلية 7. إصدار سابق من البروتوكول المعنية خطوة الحضانة في برنامج تلفزيوني يحتوي على عشر مرات أكثر تركيزا تركيز البنسلين / الستربتومايسين ل10min بعد الحصاد من الأقراص قبل هيئة مكعبlture. مع الطائرة خطوة غسل هذه الخطوة يصبح عفا عليها الزمن منذ هذه الخطوة يبدو مفيدا لأغراض زراعة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 لمحة عامة عن الخطوات المنهجية لإعداد الأقراص الفقرية العصعصية البقري مع endplates سليمة وطبقة رقيقة (1 - 2mm و) من العظام. أ) عرض تخطيطي للقرص الفقرية (IVD) وممراتها الغذائية. ب) إجراء لقطع IVD مع تخصيص شفرة حامل والصناعية شفرة حادة. C) جت الخطوة غسيل عالية لضمان بقاء الخلية ، وتمكين تبادل المغذيات حفظ endplates و 1-2 ملم من العظم يعلق على كلا الجانبين. D) وأخيرا يمكن أن يكون المثقف في IVD في غرفة عينة من مفاعل حيوي أو استخدامها لأي تطبيق أسفل النهر. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2 TOP : طول الذيل البقري الطازج كامل (مثالي obtaINED ضمن 2-3 ساعات بعد الوفاة لضمان استمرارية ارتفاع الخلية. القاع : الأشعة السينية صورة ذيل الأبقار تتراوح اعمارهم بين 6 أشهر تبين وجود لوحات النمو (GP) ، ومركز التعظم الثانوي ، وبين endplates العظمية (EP) والهيئات فقرة (VB). <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. وأدوات) لتشريح ذيل الأبقار تحت ظروف معقمة. ب) مخصص شفرة حامل لخفض التدريجي شرائح الحركي من الذيل البقري في العمل في حين خفض القرص الفقرية. C) الجانبية نظرا لتخصيص شفرة حامل بشفرة الصناعية القياسية (لوتز ، ألمانيا). <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. رسم وصورة للذيل الأبقار بعد إزالة العضلات المحيطة بها والتي توضح مواقع الرباط الشق لقطع شرائح الحركي. وينبغي أن يكون جزئيا فقرة "تصدع" وايصاحب ال شفرة مصنوعة خصيصا مثالي 1-2 ملم بعيدا عن endplates الغضروفية لضمان كامل سطح العظام. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 5"> الشكل 5. تظاهرة للتنظيف الفعال للخطوة قبل غسل النفاثة (A) وبعد (B). لاحظ السطوح النظيفة العظمي من قطاعات القرص الفقري بعد إجراء الرش. <img alt="الشكل 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 6"> الشكل 6. الحرة تورم تجربة نشر الطازجة رفعه الأقراص الفقرية ذيل الأبقار (IVDs) ترك لمدة 24 ساعة في محلول 1 ٪ procion الحمراء ، مما يدل على تأثير الحصار عن لوحة النمو. IVD والأشعة السينية الرقمية نظرا لسهمي التي لا تزال تتضمن لوحة النمو ، وطبقة ثانية من العظام صورة المجهر الفلورسنت من خلال خفض السهمي العصعصية البقري يزدرع القرص الفقرية مع endplate الغضروفية العظمية وبعد 24H نشر مجانا. سباق الجائزة الكبرى : لوحة النمو ، 2ndry ثاني : مركز ثانوي من التحجر. <img alt="الشكل 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 7"> الرقم 7. الحرة تورم تجربة الطازجة رفعه الأقراص الفقرية ذيل الأبقار (IVDs) ترك لمدة 24 ساعة في محلول 1 ٪ procion الحمراء ، مما يدل على تأثير العلاج التنظيف غسل طائرة. سميكة المقاطع السهمي (~ 100 ملم) من الأبقار IVDs رفعه مع لوحات ~ 1.5 mmthick نهاية العظمية التي خضعت الطائرة غسل المعالجة (يسار) الجانب السيطرة من دون علاج (يمين) النفاثة lavaged العلاج. مدخل يظهر نمط الرش ، التي كانت تستخدم من نظام إنضار الجرح زيمر 24H التجارب نشرها خالية من الأبقار explants القرص الفقرية في أحمر procion 1 ٪. <img alt="الشكل 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 8"> الرقم 8. الصور الحية / الميت من اسقاطات مداخن التصوير مبائر (250μm) مأخوذة من بوفينه قطاعات القرص الفقرية أعدت مع هذا الأسلوب النفاثة غسل قيد تورم خالية من 0 و 14 يوما على التوالي لالنواة اللبية (NP) ، والحلقة الليفية الداخلية (IA) والخارجي الحلقة الليفية (OA). أخضر = الخلايا خلايا حية ملطخة AM بواسطة calcein (methylester الاسيتيل) ، خلايا الدم الحمراء = نواة الخلايا الميتة التي اتسخت بسبب إيثيديوم homodimer - 1. <img alt="الشكل 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 9"> الرقم 9. بقاء الخلية من الأقراص الفقرية باستخدام الليزر مبائر المجهر على الأنسجة الحية و3D مسح المكدس. بقاء الخلية من النواة اللبية (NP) والتليف الحلقة (بالعربية) على مدى 21 يوما في إطار ثقافة حرة تورم الشرط. (متوسط ​​± SEM ، ن = 6) تم اختبار الفروق الإحصائية باستخدام غير المعلمية ، كروسكال واليس وقعت رتبة اختبار مبلغ بين الجماعات. تم العثور على اختلافات كبيرة بين يوم 21 و جميع النقاط مرة أخرى في NP. بينما في الخلافات AF كبيرة تم العثور على ما بين 7 إلى اليوماليوم 0. (* ع &lt;0.05 ** ، ع &lt;0.01).

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
<li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells%3A+a+feasibility+study+using+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li>
<li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+protocols+for+live%2Fdead+staining+in+three-dimensional+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc%2Fendplate+culture+model%3A+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li>
<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
<li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li>
<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

الخطوة الأولى للثقافة الجهاز الناجح هو للتأكد من أنه لا ينبغي أن تكون ملوثة يزدرع. وينبغي أن البشرة الذيل قبل البدء لهذا الإجراء. يمكن لأي وبر جلبت الى مختبر معقم يكون إشكاليا من حيث التلوث. وينبغي أن يكون الذيل البقري الطازج مثالي ممكن (وهذا يؤثر على بقاء الخلية الأولي). وعلاوة على ذلك ، فمن المستحسن غسل betadine الخطوة للحد من مخاطر التلوث. بدلا من استخدام حامل شفرة مصنوعة خصيصا ومطرقة لفصل IVD فقرة من الجسم ، يمكن أن يقوم بذلك عن طريق استخدام المنشار الحزامي النسيجي (ينبغي تبري...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td colspan="4"> الأبقار الطازجة الأنسجة القرص الفقرية من ذيول البقر ، من المسلخ المحلي (مثالي في غضون ساعات بعد الوفاة وبدون الجلد). </td></tr><tr><td> Pulsavac بلاس نظام AC </td><td> زيمر المؤتمر الوطني العراقي. وسويسرا </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> أفضل أداء مع رئيس الهيب مع الرش وتزويد طاقة التيار المتناوب (واحد مع حزمة بطارية AA 8 لا يعمل أيضا ولكنها أقل ملاءمة) </td></tr><tr><td> القدرات العالية فان الرذاذ ث / درع سبلاش ، وطول 12.7cm </td><td> زيمر المؤتمر الوطني العراقي. وسويسرا </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> نحن اختبار هناك العديد من رؤساء الرش المتاحة ، وهذا واحد بنجاح </td></tr><tr><td> شفرات المشرط # 22 و # 10 </td><td> سوان ، مورتعلى وانكلترا </td><td> # 10 : 0201 # 22 : 0208 </td><td></td></tr><tr><td> مشرط حامل شفرة # # 3 و 4 </td><td> هوسمان ، ألمانيا </td><td> # 3 : 06.103.00 # 4 : 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> لوتز الصناعية شفرة </td><td> لوتز ، ألمانيا </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </td><td> Invitrogen ، سويسرا </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM) </td><td> Gibco ، سويسرا </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated محلول رينغر (بدون سكر) </td><td> Bichsel ، سويسرا </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6 جيدا متعددة كذلك لوحة </td><td> TPP ، سويسرا </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine الحل </td><td> Mundipharma ، سويسرا </tد&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> الجلد الجراحية علامة </td><td> Porex الجراحية ، سويسرا </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> قطع كبيرة متنها </td><td></td><td></td><td> أي نوع من الممكن </td></tr></tbody></table>

إعداد أقراص سليمة الذيل البقري الفقرية للثقافة الجهاز

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

القرص بين الفقرات (IVD) هو مشترك في العمود الفقري لربط فقرة فقرة. وهو يعمل على إحالة التحميل للعمود الفقري واعطاء المرونة للعمود الفقري. انه يؤلف من ثلاث مقصورات : النواة اللبية الأعمق (NP) التي تضم الحلقة الليفية (AF) ، واثنين endplates غضروفية تربط NP وAF الفقري للجسم على كلا الجانبين. وقد تم تحديد الألم قرصي المنشأ الذي ربما حدث بسبب الأمراض التنكسية القرص الفقرية (DDD) وفتوق القرص باعتباره مشكلة رئيسية في مجتمعنا الحديث. لدراسة الآليات الممكنة للانحطاط IVD ، في نظم المختبر مع خلايا الجهاز الثقافة قرص العيش وجذابة للغاية. تقدمت في المختبر من ثقافة سليمة IVDs العصعصية الأبقار إلى نظام النموذجية ذات الصلة ، والتي تسمح بدراسة الجوانب البيولوجية mechano في بيئة جيدة للرقابة الفسيولوجية والميكانيكية. ويمكن الحصول على IVDs ذيل الأبقار سهلة نسبيا في ارتفاع أعداد anد متشابهة الى حد بعيد في IVDs القطني الإنسان فيما يتعلق كثافة الخلية ، والسكان ، وأبعاد الخلية. ومع ذلك ، فشلت البقري الذيلية السابقة تقنيات حصاد IVD الاحتفاظ endplates الغضروفية العظمية وendplates بعد 1-2 أيام من الثقافة منذ سدت الواضح مسارات التغذية عن طريق الدم متخدر. IVDs هي أكبر الأجهزة اوعائي ، وبالتالي ، فإن المواد الغذائية إلى الخلايا في NP تعتمد فقط على نشر عبر البراعم الشعرية من جسم الفقري المتاخمة لها. يمكن وجود حطام العظام والدم المتجلط على السطوح endplate تعرقل نشر المواد الغذائية في مركز القرص وسطا بقاء الخلية. أنشئت مجموعتنا بروتوكول سريع نسبيا &quot;الكراك&quot; التدريجي للIVDs من الذيل مع مخاطر منخفضة للتلوث. ونحن قادرون على permeabilize وطازجة وقطع الأسطح endplate العظمية باستخدام طائرة غسيل جراحية النظام ، الذي يزيل الجلطات الدموية والحطام وقطع بكفاءة عالية تعيد فتح ممر نشر التغذيةللوسط IVD. وجود لوحات النمو على جانبي العمود الفقري والعظام التي ينبغي تجنبها ، ويمكن إزالتها قبل الثقافة. في هذا الفيديو ، ونحن الخطوط العريضة للخطوات حاسمة خلال إعداد وشرح المفتاح لنجاح الجهاز ثقافة الحفاظ على سلامة الخلية عالية لمدة 14 يوما في ظل ثقافة تورم الحرة. ويمكن تمديد الوقت الذي يمكن فيه ثقافة الحفاظ على البيئة المناسبة الميكانيكية باستخدام مفاعل حيوي ميكانيكية التحميل. ويمكن تمديد هذه التقنية أثبتت هنا لأنواع الحيوانات الأخرى مثل الخنزير والأغنام والعزلة جذامي IVD الذيلية والقطنية.

يوضح هذا البروتوكول تقنية حصاد للأقراص الفقرية العصعصية البقري للثقافة الجهاز لل<em&gt; في المختبر</em&gt; الجهاز الثقافة.

يعتبر القرص بين الفقرات (IVD) المفصل الموجود في العمود الفقري والذي يربط كل فقرة بالفقرة التي تليها. وتتمثل وظيفته في نقل الأحمال الواقعة على العمود الفقري وتوفير...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير أقراص فقارية سليمة من ذيل البقر لغرض الزرع والتطبيقات اللاحقة الأخرى، وفي حالتنا هذه، لتحضير الأقراص الفقارية للزرع في مفاعل حيوي باستخدام تحميل ميكانيكي معقد. يتم تحقيق ذلك من خلال تطهير ذيل العجل أولاً، ثم إزالة العضلات للحصول على رؤية واضحة للبنى العظمية والقرصية. بعد ذلك، يتم قطع قرص فقاري واحد مع الإبقاء على جزء من الفقرة بسمك يتراوح بين 2 إلى 3 ملم ملتصقاً على كلا الجانبين باستخدام أداة قطع مخصصة.تتمثل الخطوة الثالثة في تنظيف الأسطح العظمية للقرص بين الفقرات باستخدام نظام الغسيل النفاث (jet lavage system)، لضمان انتشار المحاليل الصغيرة مثل الجلوكوز إلى مركز القرص بين الفقرات. أما الخطوة النهائية فهي وضع القرص بين الفقرات في محلول منظم مثبت أو لفه بشاش معقم للحفاظ على رطوبته من أجل التطبيقات اللاحقة. وفي النهاية، يتم تقييم نجاح الإجراء باستخدام صبغة الخلايا الحية والميتة (live dead stain) للتحقق من وجود خلايا حية بعد 14 أو 21 يوماً من بدء زراعة القرص بين الفقرات.يهدف البروتوكول التالي إلى توضيح كيفية حفظ قطع القرص القابلة للانعكاس من أجل زراعة الأعضاء، وهو ما يمكن أن يساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في الميكانيكا الحيوية وهندسة الأنسجة. وهناك سبب وجيه وراء تحول قرص ذيل البقر إلى نظام نموذجي في هندسة الأنسجة؛ فأولاً، تكون كثافة الخلايا مشابهة جداً ومنخفضة للغاية كما هي في القرص البشري الداخلي.ثانيًا، يفتقر التجمع الخلوي هناك إلى الخلايا الوترية، وهو أمر مشابه جدًا للحالة البشرية. ثالثًا، تتشابه الأبعاد والتركيب الكيميائي الحيوي بشكل كبير مع الحالة البشرية. وبشكل عام، سيواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات بسبب صعوبة التمييز بين الصفيحة النهائية العظمية وعظم الفقرة، وبالتالي سيجد المرء صعوبة في التأكد من وجود صفيحة نمو غضروفية.خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نبحث عن تقنية سريعة ومعقمة لعزل القرص القابل للعكس مع الصفيحة النهائية من أجل الزراعة الفردية. ويعد التوضيح المرئي لهذه الطرق أمراً هاماً نظراً لصعوبة تحديد موقع القطع، حيث يقع موقع القطع على بعد مليمتر واحد فقط من الصفيحة العظمية. أولاً، يتم الحصول على ذيل بقري كامل من مسلخ محلي.من الناحية المثالية، يجب ألا يتجاوز الوقت المنقضي على الذيل أربع ساعات بعد الوفاة، ويجب الحصول عليه بعد إزالة الجلد. ونظرًا لأن وجود الجلد يزيد من احتمالية التلوث، يجب التأكد من تعقيم جميع الأدوات التي ستُستخدم في عملية التشريح. كما يجب تجهيز محطة عمل معقمة عن طريق وضع لوح تقطيع معقم بجهاز الأوتوكلاف على سطح العمل.بعد ذلك، وأثناء العمل داخل غطاء تدفق صفائحي معقم، قم بترطيب قطعة من الشاش المعقم بمحلول كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.9% والذي يحتوي على 55 millimolar من سترات الصوديوم. ضع قطعة من الشاش المبلل في كل بئر من أطباق الزراعة ذات الستة آبار. بعد ذلك، املأ حوضاً نظيفاً بمحلول Betadine مخفف بماء الصنبور بنسبة 1 إلى 100، واغمر الذيل في المحلول لمدة خمس دقائق.بعد النقع، قم بإزالة الذيل. جففه لفترة وجيزة باستخدام شاش معقم وضعه على محطة العمل المعقمة. أولاً، استخدم مشرطاً مقاس 20 أو 22 لإزالة العضلات المحيطة بالذيل. ثم استخدم مقصلة لقطع أي أجزاء غير مرغوب فيها من الذيل، وعادة ما يكون ذلك من الطرفين القريب والبعيد، واللذين يحتويان على أقراص بين فقارية كبيرة جداً وصغيرة جداً نسبياً.بعد ذلك، استخدم مشرطاً مقاس 10 لتقليم العضلات والأوتار المحيطة بالأقراص بين الفقرات. احرص على عدم قطع الحلقة الخارجية للأقراص إذا كان ذلك ضرورياً. ولأغراض التوجيه، حدد الجزء الأمامي من القرص بين الفقري باستخدام قلم تحديد جراحي للجلد.بعد ذلك، حرك الذيل برفق لتحديد موقع القرص بين الفقرات ونقطة الاتصال الفقارية. استخدم الجانب غير الحاد من شفرة المشرط لتحديد الحدود بين القرص بين الفقرات والعظم. ثم حدد موقع نقطة الشق، والتي يجب أن تبعد من 1 إلى 2 mm عن القرص بين الفقرات باتجاه الفقرة.ضع حامل الشفرة الصناعي المصنع خصيصًا على موقع الشق. يوضح هذا المخطط موقع الشق بوضوح تام. قم بشق القرص بين الفقرات والفقرات عن طريق الطرق فوق حامل الشفرة الصناعي المصنع خصيصًا. بعد ذلك، انقل حامل الشفرة إلى الجانب الآخر من اتصال القرص بين الفقرات بالفقرات، ثم اطرق من خلال هذا الجانب من اتصال القرص بالفقرات لتحرير القرص بين الفقرات.بعد ذلك، يتم عزل القرص بين الفقرات بسرعة باستخدام شاش معقم مبلل بمحلول كلوريد الصوديوم 0.9% الذي يحتوي على 55 millimolar من سترات الصوديوم. تكرر العملية للحصول على العدد المطلوب من الأقراص بين الفقرات. عادةً ما يمكن الحصول على حوالي ستة أقراص يتراوح قطرها بين 10 إلى 20 millimeters من ذيل واحد.بمجرد حصاد جميع الأقراص القابلة للقلب، قم بتوصيل نظام الغسيل النفاث بكيس سعة ثلاثة لترات من محلول رينجر اللاكتات المعقم، أو محلول PBS المعقم، أو محلول ملحي معقم بتركيز 0.9%. بعد ذلك، أمسك قرصاً قابلاً للقلب باستخدام الملقط وقم بغسل كلا جانبي سطح الصفيحة النهائية بالغسيل النفاث لمدة 30 ثانية لكل جانب، مع الحفاظ على جهاز الغسيل النفاث بزاوية تتراوح من 30 إلى 60 درجة بالنسبة لسطح الصفيحة النهائية؛ وتوضح هذه الصورة تأثير التنظيف الناتج عن الغسيل النفاث. يظهر الصف العلوي من الأقراص الأقراص القابلة للقلب قبل التنظيف، بينما يظهر الصف السفلي الأقراص نفسها بعد التنظيف.بمجرد غسل القرص الفقري الأول، قم بلفه في شاش رطب أثناء غسل الأقراص الفقرية الأخرى. بعد الغسل، تصبح الأقراص الفقرية جاهزة للزراعة العضوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تجربة انتشار لتحديد مدى نجاح تحضير القرص الفقري أثناء العمل داخل غطاء التدفق الصفائحي.قم بتحضير 40 milliliters من وسط استزراع DMEM المعقم الذي يحتوي على 5% fetal calf serum لكل قرص. انقل الوسط إلى دورق ثم اغمر قرصاً فقارياً واحداً في الوسط. ضع الدورق على منصة هزازة داخل حاضنة زراعة الأنسجة مضبوطة على 37 degrees Celsius و5% carbon dioxide.يمكن زراعة الأقراص بين الفقرات بهذه الطريقة لمدة 14 يوماً تقريباً. ويؤدي استخدام غرف العينات المصنعة خصيصاً هذه إلى الحفاظ على حمل ميكانيكي مناسب، مما يسمح بتمديد فترة الزراعة. أولاً، قم بتحضير 40 milliliters من وسط زراعة DMEM المعقم الذي يحتوي على 5%fetal calf serum لكل قرص كما سبق.بعد ذلك، ضع القرص القابل للعكس في إحدى غرف الزراعة المصنعة خصيصاً، وأضف 40 milliliters من الوسط الغذائي المُحضّر حديثاً. أغلق الغرفة تحت غطاء التدفق الصفائحي. ثم ضع غرفة العينات المصنعة خصيصاً في حاضنة زراعة الأنسجة.أضف ثقلاً إلى الحجرة وفقاً لمساحة سطح الأقراص. أولاً، قم بتحضير 100 milliliters من محلول بتركيز 1% من صبغة فلورية، مثل proso red في PBS لكل قرص فقاري. ثم اغمر القرص في المحلول وحضنه طوال الليل تحت نفس الظروف.أما بالنسبة لمزرعة التورم الحر بعد فترة الحضن، فيتم تجميد القرص تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل ثم غمره في الأسيتون عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. بعد ذلك، يتم إرجاع القرص الفقرِي ببطء إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق الحضن لمدة 24 ساعة في الأسيتون عند درجة حرارة 20- درجة مئوية، ثم 4 درجات مئوية، وأخيراً في الأسيتون عند درجة حرارة الغرفة. وبعد استعادة القرص لدرجة حرارة الغرفة، يتم تضمين القرص بالكامل في مادة polymethyl methacrylate لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين وفقاً للإجراءات القياسية.بمجرد اكتمال عملية الطمر، يتم تجهيز القرص عن طريق قطعه بشفرة حادة وصقله باستخدام جلاخة. وبعد التجهيز، يمكن تقييم انتشار pro cy red في جميع أنحاء القرص بواسطة المجهر. وتوضح هذه الصور نتائج تجربة انتشار الانتفاخ الحر.يوضح اللوح C نظرة عامة بالأشعة السينية لقرص قابل للانعكاس مع تحضير الصفيحتين الطرفيتين العظميتين باستخدام طريقتنا. في الجانب العلوي، لم تتم إزالة صفيحة النمو التي صُوّرت تحت المجهر الفلوري. ويمكن ملاحظة أن انتشار الصبغة الفلورية الحمراء قد تم حجبُه بوجود صفيحة النمو المحددة بـ gp، والتي تعمل بالتالي كحاجز يمنع صبغ الطبقات العميقة من الصفيحة الطرفية الغضروفية والقرص القابل للانعكاس.تقع صفيحة النمو بين مركزي التعظم الأولي والثانوي المحددين بـ co. وفي حال تمت إزالة صفيحة النمو بنجاح، يمكن للصبغة الفلورية الحمراء أن تنتشر دون عوائق وصولاً إلى النواة اللبية المحددة بـ np. وتوضح هذه الصور تأثير التنظيف الناتج عن علاج الغسيل النفاث.يبلغ سمك المقاطع السهمية حوالي 100 microns، بينما يبلغ سمك الصفائح الطرفية العظمية حوالي 1.5 millimeters. هنا، خضع القرص بين الفقرات لعلاج الغسيل النفاث (jet lavage)، ويمكن رؤية انتشار الصبغة عبر الصفيحة الطرفية. ومع ذلك، لا تنتشر الصبغة بشكل جيد في الجانب الضابط الذي لم يتم فيه إجراء علاج الغسيل النفاث.نرى هنا صوراً مجهرية بؤرية (confocal) لصبغة الخلايا الحية والميتة، مأخوذة من قطع قرص فقاري بقري قابلة للانعكاس تم تحضيرها باستخدام طريقة الغسل النفاث هذه وحُفظت في ظروف انتفاخ حر؛ حيث تم تمييز نتوءات القطب النواتي بالرمز np، والحلقة الليفية الداخلية بالرمز IA، والحلقة الليفية الخارجية بالرمز oa. تمثل المناطق الخضراء الخلايا الحية المصبوغة بـ calcium acetyl methyl ester، بينما تمثل المناطق الحمراء نويات الخلايا الميتة المصبوغة بـ acridine orange. وتوضح الصور المأخوذة من المناطق نفسها هنا أن عدداً كبيراً من الخلايا القابلة للحياة، والتي يشير إليها الفلورسنت الأخضر، تظل موجودة بعد 14 يوماً في ظروف الانتفاخ الحر.يوضح هذا الرسم البياني حيوية الخلايا في منطقتي النواة اللبية والحلقة الليفية للأقراص بين الفقرات على مدار فترة زرع استمرت 21 يومًا، حيث تمثل النتائج المتوسط الحسابي زائد أو ناقص الخطأ المعياري للمتوسط لست عينات. وكما هو موضح، تم اختبار الفروق الإحصائية باستخدام اختبارات Rosco Wallace signed ranked sum غير المعلمية بين المجموعات.وُجدت فروق ذات دلالة إحصائية بين اليوم 21 وجميع النقاط الزمنية الأخرى في النواة اللبية (nucleus pulsus)، بينما في الحلقة الليفية (annulus fibrosis)، وُجدت فروق ذات دلالة إحصائية بين اليوم السابع واليوم صفر. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تعديل ظروف الزرع هذه من أجل الإجابة على تساؤلات إضافية، مثل تأثير التحميل الميكانيكي، أو العوامل الغذائية، أو عوامل النمو على تطور هذا التنكس أو التجدد. يساهم البروتوكول الخاص بنا في تسريع تقنية الحصاد، وكيفية الحصول على قطع قرصية قابلة للتفسير لاستخدامها في نهج هندسة الأنسجة لقياس الفسيولوجيا أو الميكانيكا الحيوية. وفي الطرق التقليدية، يتم استخدام المنشار الشريطي النسيجي أو تقنية التحميل، والتي تستغرق وقتاً أطول بنحو ساعتين مقارنة بالبروتوكول الخاص بنا.

preparation-intact-bovine-tail-intervertebral-discs-for-organ

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

وتستخدم Explants من المخ الأوسط نظام الدوبامين والمخطط في الكولاجين فحص مصفوفة...

تشريح والثقافة من الدوبامين والفأر Explants العقدة المخططة في ثلاثي الأبعاد فحوصات مصفوفة الكولاجين

يوضح هذا الفيديو إنشاء ثقافات الأعضاء المشيمية والمشيمية الأولية للإنسان في ظروف خارج الجسم الحي. هذه النماذج مناسبة تماما لدراسة التسبب في الواجهة بين الأم والجنين.

إنشاء مزارع الأعضاء الزبيثة والمتساقطة كنماذج خارج الجسم الحي للواجهة بين الأم والجنين

يوضح هذا الفيديو طريقة لإنشاء نموذج عدوى في أنسجة المشيمة لدراسة انتشار العدوى. تصاب زراعة الأعضاء المشيمية خارج الجسم الحي ب Listeria monocytogenes ، وهو طفيلي اختياري داخل الخلايا. تغزو البكتيريا الأرومات الغاذية خارج الزغابات (EVTs) لدخول أنسجة المشيمة ثم تنتشر إلى خلايا أخرى عن طريق انتشار خلية إلى أخرى.

تقنية لإنشاء نموذج عدوى بكتيرية في مزرعة الأعضاء خارج الجسم الحي

يوضح هذا الفيديو تقنية لزراعة الأقراص الفقرية البقرية في المفاعلات الحيوية لتطوير نموذج ثقافة أعضاء ثلاثي الأبعاد. يتم تطبيق وسائط محددة محرومة من المغذيات وظروف الضغط التنكسي على الأقراص ، مما يحاكي البيئة المكروية المؤيدة للالتهابات والتنكسية التي لوحظت أثناء مرض القرص الفقري في المرحلة المبكرة. يتم قياس ارتفاعات القرص بعد المعالجة لتحليل آثار الحرمان من المغذيات والتحميل التنكسي.

إنشاء نموذج لزراعة الأعضاء المؤيدة للالتهابات لمحاكاة مرض القرص الفقري المبكر

يوضح هذا الفيديو تطوير نموذج ثقافة الأعضاء المؤيد للالتهابات والتنكسية لمرض القرص الفقري في المرحلة المبكرة (IVD) باستخدام عامل نخر الورم α. يحدد إجراء حقن عامل نخر الورم α في القرص الفقري ويشرح الآليات التي من خلالها يتسبب عامل نخر الورم α في التهاب وتدهور الأنفاب.

إنشاء نموذج لزراعة الأعضاء لمحاكاة مرض القرص الفقري في المرحلة المبكرة

الثقافة الجهاز كاملة من القرص الفقرية (IVD) يحافظ على مصفوفة الأم خارج الخلية، خلية الظواهر، والتفاعلات الخلوية مصفوفة. نحن هنا وصف نظام الثقافة IVD باستخدام الماوس قطني وIVDs الذيلية في وحدات العمود الفقري وظيفية، والعديد من التطبيقات التي تستخدم هذا النظام.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

يقدم هذا البروتوكول نموذجا تجريبيا جديدا لثقافة الأعضاء البقرية التنكسية proinflammatory لمحاكاة انحطاط القرص الفقري في مرحلة مبكرة.

نموذج ثقافة الأعضاء التنكسية Proinflammatory لمحاكاة مرض القرص الفقري في مرحلة مبكرة.

نقدم طريقة للتحقيق في تنظيم الخلايا الشوندروسيتية المكانية في الورم الليفي أنولوس للقرص الفقري باستخدام طريقة تقسيم بصري.

المقطع البصري والتصور للقرص الفقري من التطور الجنيني إلى الانحطاط

تقدم هذه الدراسة تقنية جراحية جديدة لزرع قرص فقري اصطناعي محاكي حيوي (BioAID). تضمن هذه الطريقة وضعا دقيقا واستقرارا ، بهدف استعادة وظيفة العمود الفقري العنقي باستخدام نموذج الماعز. تظهر هذه التقنية وعدا للتطبيق السريري في كل من المرضى من البشر الذين يعانون من اعتلال النخاع في العمود الفقري العنقي.

تقنية جراحية لزرع قرص فقري اصطناعي محاكاة حيوية في نموذج ماعز

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح التقنيات المستخدمة لصنع التجريبية ، متوافقة مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) ركائز مغلفة مناسبة لزراعة الخلايا ، والتي هي قابلة للالمجهري قوة الجر ومراقبة الآثار المترتبة على تصلب ECM على سلوك الخلية.

إعداد مصفوفات شكوى لقياس تقلص الخليوي

تعلم تقنية حصاد أقراص العمود الفقري البقري السليمة للثقافة الجهازية باستخدام أدوات قطع مخصصة ونظام غسيل ضغطي. تتيح هذه الطريقة للباحثين دراسة ميكانيكا الأقراص والأحمال الميكانيكية المعقدة.

إعداد أقراص سليمة الذيل البقري الفقرية للثقافة الجهاز

استكشف المزيد من الفيديوهات