تصور كا الأوعية الدموية ^{2 +} اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور إشارات الكالسيوم الوعائية التي تسببها أنواع الأكسجين التفاعلي المشتق من المحيط أو r os. يتم تحقيق ذلك من خلال تصور R OS أولا باستخدام الأصباغ الحساسة للأكسدة في الضامة النشطة. يمكن أيضا تصور أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا البطانية باستخدام مستشعرات الفلورسنت القائمة على البلازميد.

ثم انتقل إلى تصور متعقب الخلايا في نفس الوقت ، والضامة المنشطة ذات العلامات الحمراء والإنفلونزا لأربع خلايا بطانية مصنفة في نموذج زراعة مشتركة. أخيرا ، قم بقياس إشارات الكالسيوم في الخلايا البطانية التي تسببها البلاعم المشتقة R os. باستخدام نظام التصوير متحد البؤر.

يمكن أن توضح هذه النتائج مستويات R OS بشكل مستقل بالإضافة إلى تقييم تعبئة الكالسيوم داخل الخلايا الناتجة عن ROS المشتق من Peregrine. تتيح هذه الطريقة التقييم المتزامن لجزيئين مختلفين للإشارات التي تثير بشكل وثيق إشارات الأوعية الدموية وإعداد الفيزيولوجيا المرضية للمحاكاة. سيوضح اثنان من باحثي ما بعد الدكتوراه في مختبري ، كارثيك وراج الإجراء الخاص بقياسات الكالسيوم الخام والكالسيوم وتفاعلات الخلايا البطانية للبلاعم.

ثقافة الفأر أحادية الخلية البلاعم على أطباق زجاجية 35 ملم. ثم تحدى الخلايا بناهضات مستقبلات شبيهة بالحصيلة واحتضانها لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية. لتصور الخلوي.

يضيف ROS صبغة حساسة للأكسدة ويحتضن الخلايا لمدة 20 دقيقة. الآن تصور الخلايا في مرحلة التحكم في درجة الحرارة لنظام التصوير متحد البؤر. بدلا من ذلك ، لتصور ROS للميتوكوندريا في الخلايا المنشطة TLR ، أضف مؤشر فائق أكسيد الميتوكوندريا واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

للتحكم السلبي ، عالج الخلايا إما ب PBS أو DMSO للحصول على تحكم إيجابي. عالج الخلايا باثنين من ملي مولار أنتيمايسين. المضي قدما في تصور جميع الخلايا في مرحلة التحكم في درجة الحرارة لنظام التصوير متحد البؤر.

باستخدام برنامج الصورة J ، قم بتحليل جميع بيانات الصورة. يستشعر مستشعر الفلورسنت المفرط على وجه التحديد تركيزات البيروكسيد الفرعية الميكرومولار وبناء على تعبير الثدييات ، يمكن استهداف تصميم المتجهات إما للسيتوبلازم أو الميتوكوندريا. باستخدام التثقيب الكهربائي ، قم بإنشاء خطوط مستقرة من الخلايا البطانية القلبية الرئوية للفأر التي تحمل بلازميد مفرط التعبير غير مناسب.

لتسهيل خلايا صفيحة نمو المستعمرة بكثافة منخفضة في TMEM الكامل واحتضانها لمدة 48 ساعة ، استبدل الوسط بوسط مزرعة كامل مكمل بمضاد حيوي مختار. استنساخ الشاشة لأعلى نسبة من الخلايا شديدة الإيجابية وتضخيم الثقافة لإنشاء خطوط إيجابية مفرطة المستقرة في التجارب الفردية. خلايا البذور على زلات غطاء مغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.2٪ وزراعتها طوال الليل إلى التقاء 80٪.

الآن قم بتنشيط الخلايا باستخدام روابط TLR واحتضانها لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية. للكشف عن ROS السيتوبلازمي ، قم بتركيب زلات غطاء الخلايا على غرفة خلية الأديلو. أضف ملليلترا واحدا من خزانات التسخين ، ووازن محلول الملح ووضع الغرفة في مرحلة يتم التحكم في درجة حرارتها لنظام التصوير متحد البؤر.

سجل تغيرات التألق في الخلايا للكشف عن الميتوكوندريا. روس. قم بتضمين تحكم إيجابي في اثنين من مضادات المايسين الميكرومولار A. ثم قم بإعداد زلات غطاء الخلايا المعالجة للفحص المجهري متحد البؤر. إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج الصورة J.

ابدأ بالخلايا البطانية التي تنمو إلى التقاء بنسبة 80٪ على زلات الغطاء الزجاجي المطلي بالجيلاتين لتصور وقياس تغيرات الكالسيوم داخل الخلايا. احتضان الخلايا في صبغة الفلورسنت الأنفلونزا أوه 4:00 صباحا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتقليل فقدان الصبغة يغسل الخلايا بمحلول تصوير تجريبي يحتوي على منطقة سوين بايرو. الآن ينزلق غطاء التثبيت على غرفة خلية adelo عند 800 ميكرولتر من محلول التصوير التجريبي الدافئ مسبقا ويضع الخلايا في مرحلة يتم التحكم في درجة حرارتها لنظام التصوير متحد البؤر في أنبوب منفصل.

استخدم 500 نانوغرام لكل ملليلتر من متتبع الخلايا الأحمر C-M-T-P-X لمدة 15 دقيقة لتسمية مجموعة البلاعم الخاضعة للفحص ، وغسل الخلايا وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من محلول التصوير التجريبي. أضف الآن البلاعم المسمى إلى الأنفلونزا أوه 4:00 صباحا محملة. تسجل الخلايا البطانية في مجموعة الغرفة متحدة البؤر التألق الأخضر والأحمر كل ثلاث ثوان لمدة 10 دقائق.

في هذه التجربة ، تم تحدي خلايا J 7 74 0.1 مع TLR اثنين وثلاثة وأربعة روابط لمدة ست ساعات. تظهر الصور متحدة البؤر التمثيلية زيادة R os العصارة الخلوية كما تم قياسها بواسطة DCF. ومن المثير للاهتمام أن الجوارب الميتوزية ذات اللون الأحمر يشير إلى زيادة مماثلة في ROS في الميتوكوندريا.

هذه التغييرات الفلورية كمية. وبالتالي يجب تطبيع النتائج والتعبير عنها كتغيير نسبي في الطية لكل علاج ، فإن إشارة antimycin a تتحقق من صحة التحكم الإيجابي في إنتاج ROS في الميتوكوندريا. يوضح هذا الشكل صورا لمستويات بيروكسيد البطانة والعزول الخلوي والميتوكوندريا في التعبير بثبات عن فرط سيتو أو فرط D mito.

تم تحفيز MP ECS مع ناهضات TLR. يوضح القياس الكمي لمتوسط تغير التألق زيادة التألق المفرط و D المفرط بعد ست ساعات من التحفيز في نظام الزراعة المشتركة. لتقييم Peregrine ROS التي تشير إلى ضمة ميرين المعزولة حديثا من كل من النوع البري و GP 91 Fox الفارغة تم تنشيطها بواسطة ميكروغرام واحد لكل مليلتر من LPS لمدة ست ساعات.

تم تصنيف البلاعم باللون الأحمر باستخدام C-M-T-P-X وأضيفت إلى الأنفلونزا الخضراء الأربعة. تحميل. MPM ecs. ومن المثير للاهتمام ، أن البلاعم المنشطة LPS المعزولة من الفئران البرية تسببت في تعبئة الكالسيوم الكبيرة والسريعة في MPM ECS مقارنة بالبلاعم من الفئران الفارغة GP 91 Fox.

بينما محاولة LI اتخاذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن التنزيل المطول أو التعرض لليزر يؤدي إلى الأكسدة التلقائية ل DCF. من الأهمية بمكان تجنب تبييض الصور لفرط سيتو وفرط D ميترال. بمجرد إتقان قياس RA في الضامة وكذلك في الخلايا البطانية ، يمكن إجراؤه في سبع ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.