التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس حركية التفاعل بين المستقبِل والرابِط عندما يكون كلا الجزيئين مثبتين على أسطح الخلايا المتفاعلة. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق وظيفية خلايا الدم الحمراء، والتي تعمل كمستشعرات للالتصاق، باستخدام الروابط، وتحضير الخلايا الحاملة للمستقبلات. وفي الخطوة الثانية، يتم تجميع غرفة الماصة الدقيقة وإجراء اختبارات الالتصاق لتسجيل أحداث الالتصاق.

بعد ذلك، يتم رسم منحنى احتمالية الالتصاق مقابل وقت تلامس الخلايا ومطابقته مع النموذج. ومن أجل تقدير معاملات الحركية، يتم الحصول على نتائج توضح تقارب الارتباط الفعال ثنائي الأبعاد ومعدل الانفصال المقدر من البيانات. إذن، من أين استمددنا فكرة هذا المقايسة؟

يدرس الباحثون التفاعل بين المستقبل والرابط. ويقوم معظمهم بقياس قوى التمزق، وهو ما نفعله أيضاً، ولكن في أحد الأيام فكرنا فيما إذا كان بإمكاننا ببساطة قياس النتيجة الثنائية: صفر في حالة عدم وجود التماسك وواحد في حالة وجود التماسك، ومن ثم استخلاص قياسات الحركية من تلك القياسات (صفر-واحد) لعرض مقايسة تردد الأنابيب الدقيقة. ستقوم الدكتورة فيرونيكا زانا زينا، الباحثة العلمية في مختبري، بعرض هذه التجربة لكم.

يتم وضع البيوتين على خلايا الدم الحمراء المعزولة من الدم الكامل من أجل اختبار تكرار الالتصاق. لبدء هذا الإجراء، قم بطرد مركزي للأنبوب الذي يحتوي على خلايا الدم الحمراء المعزولة، ثم وزع 10 µL من رواسب خلايا الدم الحمراء في كل واحد من عدة قوارير، وأضف الكمية المناسبة من PBS إلى كل قارورة لتحضير تركيزات متعددة من إزالة البيوتين من خلايا الدم الحمراء. بعد ذلك، أضف 10 µL من محلول منظم bore eight بتركيز 0.1 molar إلى كل قارورة.

بعد ذلك، أضف كمية محسوبة من محلول البيوتين إلى كل أنبوبة واخلطها فوراً باستخدام جهاز الـ vortex. ولمدة عدة ثوانٍ، ضع كل أنبوبة تحتوي على خلايا الدم الحمراء داخل أنبوبة مخروطية سعة 50 milliliter وحضنها على جهاز الدوار (rotator) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة؛ وبعد مرور 30 دقيقة، أضف محلول EAS 45 buffer إلى كل أنبوبة وقم بالطرد المركزي لمدة دقيقتين بسرعة 2000 rotations per minute. كرر عملية الغسل باستخدام EAS 45 buffer مرتين، ليصبح إجمالي عدد مرات الغسل ثلاث مرات.

أخيرًا، أضف 100 µL من محلول EAS 45 المنظم إلى كل أنبوبة واحفظها في درجة حرارة 4 °C لتوظيف اللجائن على سطح خلايا الدم الحمراء. بعد أن تم تنشيطها في الخطوة السابقة، تُحضن خلايا الدم الحمراء مع تركيز مشبع من strep TTR لمدة 30 دقيقة عند 4 °C، ثم تُغسل ثلاث مرات بمحلول EAS 45 المنظم لمدة دقيقتين بسرعة 2000 rpm. بعد ذلك، يتم تحضين خلايا الدم الحمراء إما مباشرة مع اللجين المبيوتن، أو تحضين خلايا الدم الحمراء مع الجسم المضاد الالتقاطي المبيوتن المقابل متبوعًا بالتحضين مع اللجائن. يستخدم البروتوكول الموضح في هذا الفيديو الجسم المضاد الالتقاطي المبيوتن.

تُصنع الماصات الدقيقة باستخدام أنابيب شعيرية من زجاج البوروسيليكات ذات نقطة انصهار محددة. أولاً، استخدم جهاز سحب الماصات الدقيقة لسحب الأنابيب الشعيرية. بعد ذلك، استخدم مناوراً دقيقاً مع جهاز صهر دقيق لقطع طرف الماصة الدقيقة للوصول إلى حجم الفتحة المطلوب.

يتراوح القطر المطلوب عادةً من 1 إلى 5 ميكرونات اعتماداً على حجم الخلايا المستخدمة في الدراسة. ولتجهيز حجرة الخلايا، استخدم قطعتين من غطاء شريحة المجهر مقطوعتين إلى الحجم المطلوب، ونظف الغبار عن أغطية الشرائح باستخدام منفاخ هواء، ثم أضف وسط حجرة الخلايا وأغلق الحجرة باستخدام الزيت المعدني من كلا الجانبين لمنع تبخر الوسط، حيث سيؤدي ذلك إلى تغيير الأسمولية أثناء التجربة.

يتكون نظام الماصة الدقيقة المستخدم في هذا المقايسة من ثلاثة أنظمة فرعية: نظام فرعي للتصوير لمراقبة وتسجيل وتحليل حركات الخلية التي يتم سحبها بواسطة الماصة الدقيقة، ونظام فرعي للمناولة الدقيقة لتمكين اختيار الخلايا من حجرة الخلايا، ونظام فرعي للضغط لسحب الخلايا إلى داخل الماصات الدقيقة. وتتمثل القطعة المركزية في نظام التصوير الفرعي في مجهر مقلوب بعدسة غمر زيتية بقوة تكبير 100 مرة. يتم رصد صور العدسة الشيئية بواسطة كاميرا ذات جهاز شحن مقترن وتُرسل إلى مسجل كاسيت فيديو.

يتم ربط مؤقت فيديو بالنظام لتتبع الوقت. بعد ملء الماصة الدقيقة بماء منزوع الأيونات، ضعها في حاملها المثبت على مشغل ميكانيكي راكب على المجهر. يمكن تحديد موضع الماصة الدقيقة بدقة باستخدام مناول ميكروني هيدروليكي ثلاثي المحاور.

تم تركيب أحد حوامل الماصات الدقيقة على محول بيزوكهربائي مبرمج بواسطة الحاسوب. وهذا يسمح بتحريك الماصة بدقة وضمن دورة اختبار الالتصاق. ويُستخدم النظام الفرعي لتنظيم الضغط للتحكم في عملية الشفط.

خلال التجربة، يربط خط هيدروليكي حامل الماصة الدقيقة بخزان سائل. ويسمح محدد موضع ميكانيكي دقيق بالتحكم الدقيق في ارتفاع الخزان. بعد تجميع الغرفة، يتم ضبط الماصات الدقيقة، ثم تُحقن الخلايا في الغرفة لبدء المقايسة، وتُسحب الخلايا المتفاعلة بواسطة الماصات الخاصة بها، ويُستخدم المترجم الكهربائي PSO لدفع خلية الدم الحمراء للدخول في تلامس مع الخلية المتعادلة والخروج منه، مع التحكم في مساحة ووقت التلامس.

تتم ملاحظة حدث الالتصاق عندما تستطيل خلية الدم الحمراء عند انفصال الخلية، بينما يشير حدث عدم الالتصاق إلى عدم استطالة خلية الدم الحمراء. قم بتسجيل أحداث الالتصاق الملحوظة بإضافة واحد للالتصاق أو صفر لعدم الالتصاق في عمود ضمن جدول بيانات Excel.

سجل منحنى تردد الالتصاق مقابل زمن التلامس باستخدام ثلاث أزواج خلوية مختلفة على الأقل لكل زمن تلامس. وللحصول على المتوسط والخطأ المعياري للمتوسط (SEM) كعنصر تحكم، سجل منحنى الارتباط غير النوعي باستخدام خلايا دم حمراء مغطاة بربيطات ذات صلة و/أو عن طريق حجب الربيطات أو المستقبلات باستخدام حاجب وظيفي نوعي. وباستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة، يمكن حساب تردد الالتصاق النوعي عند كل نقطة زمنية للتلامس عن طريق طرح تردد الالتصاق غير النوعي.

يتم ملاءمة بيانات تردد الالتصاق النوعي مقابل وقت التلامس باستخدام نموذج احتمالي يصف تفاعلاً أحادي الخطوة من الدرجة الثانية في الاتجاه الأمامي والدرجة الأولى في الاتجاه العكسي بين نوع واحد من المستقبلات ونوع واحد من اللجينات؛ وفي هذه المعادلة، تمثل KA الألفة ثنائية الأبعاد، بينما تمثل KA معدل التفكك ثنائي الأبعاد.

تمثل MR و ML كثافة المستقبلات والليجاند على التوالي، بينما تمثل AC مساحة التلامس. يتضمن ملاءمة المنحنى معلمتين، ac و k و a و K off، حيث يتم دمج AC و KA معاً وتسميتهما مجتمعة بالألفة ثنائية الأبعاد الفعالة؛ وحاصل ضرب هذه الألفة في معدل الانفصال هو معدل الارتباط ثنائي الأبعاد الفعال AC K on يساوي AC KA مضروبة في K off. يظهر هنا مثال على تحديد integrin alpha L beta two.

كثافة الموقع على الخلايا المتعادلة. تم تحضين الخلايا المتعادلة أولاً بتركيز 1 µg/mL من E selectin IG، ثم أضيفت تركيزات مشبعة من anti-human CD 11 المرتبط بـ PE، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة أو IgG1 من الفأر كعنصر تحكم ملائم. وبعد تحضين لمدة 30 دقيقة، غسلت العينات وقُرئت بواسطة مقياس التدفق الخلوي باستخدام كمية قياسية.

خرزات معايرة PE الساطعة. يوضح اللوح A مخططات توزيع الفلورة لخرزات المعايرة جنباً إلى جنب مع مخططات توزيع الخلايا المعالجة أو غير المعالجة بـ E selectin IG. يظهر صبغ الجسم المضاد أحادي النسيلة النوعي لـ CD 11 A في المنحنيات المتصلة، بينما يظهر صبغ الجسم المضاد الضابط المطابق للنمط المناعي ذي الصلة في المنحنيات المنقطة.

يُظهر الجزء B عملية التكميم الكثافي. تم حساب لوغاريتم 10 (Log 10) لمتوسط شدة الفلورة لكل خرزة من الخرزات الأربع. قيمة ذروة المعايرة من الجزء A ولجزيئات PE الخاصة بكل تشغيلة لكل خرزة.

تم رسم تحليل انحدار خطي لـ log 10 لعدد جزيئات PE لكل خرزة مقابل log 10 للفلورة للخلايا المتداخلة التي أعيد اختيارها. كانت قيمة Log 10 fi تساوي 3.99 مشار إليها بالدائرة الزرقاء المصمتة، و 2.23 مشار إليها بالدائرة الزرقاء المفتوحة للأجسام المضادة أحادية النسيلة النوعية وللأجسام المضادة الضابطة على التوالي. وعندما تم حل المعادلة الخطية لـ X، تم حساب العدد الإجمالي لـ alpha L beta two أو الخلايا المتعادلة بـ 9, 587.

تم حساب الكثافة السطحية لتكون 43 موقعاً لكل ميكرون مربع، بافتراض أن قطر الخلية المتعادلة هو 8.4 ميكرون. يوضح الرسم البياني التالي تردد الالتصاق المتراكم fi للارتباط النوعي عند ثانية واحدة و10 ثوانٍ. تم قياس أوقات التلامس من دورات اختبار الالتصاق المتكررة بين خلايا دم حمراء مطلية بـ ICAM one وخلايا متعادلة بشرية تعبر عن integrin alpha L beta two.

وعلى النقيض من ذلك، يظهر هنا تردد الالتصاق التشغيلي fi للارتباط غير النوعي عند أوقات تلامس قدرها ثانية واحدة وعشر ثوانٍ، والتي تم قياسها من دورات اختبار التصاق متكررة بين خلايا دم حمراء مغطاة بـ IgG بشري وخلايا متعادلة بشرية تعبر عن integrin alpha L beta two. ويوضح هذا الرسم البياني النهائي حركية ارتباط I A one بـ integrin alpha L beta two في الخلايا المتعادلة، حيث تم حساب متوسط احتمالات الالتصاق المقاسة لثلاثة أزواج من الخلايا عند كل وقت تلامس ورسمها مقابل وقت التلامس للتحكم في الارتباط غير النوعي. وقد تم استخدام حالتين مختلفتين.

خلايا دم حمراء واحدة مغلفة بالأجسام المضادة لالتقاط TFC ومحضنة مع IgG البشري بدلاً من ICAM one IG، وخلايا متعادلة عددها اثنان ترتبط بخلايا دم حمراء غير مغلفة بالأجسام المضادة لالتقاط. استُخدم منحنى التحكم لـ IgG البشري، والذي سجل الارتباط غير النوعي، للحصول على منحنى احتمالية الالتصاق النوعي. تم استخدام المعادلة الموضحة سابقاً لتصحيح الارتباط غير النوعي.

تم مطابقة منحنى احتمالية الالتصاق النوعي المصحح باستخدام مطابقة النموذج. وقد أعطى منحنى احتمالية الالتصاق النوعي تقارب الارتباط الفعال. حيث بلغت قيمة CKA مقدار 1.4 × 10⁻⁴ µm⁴ وقيمة koff مقدار 0.3 s⁻¹.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية قياس حركية التفاعل بين المستقبل والرابط عندما يكون كلا الجزيئين مثبتين على أسطح الخلايا المتفاعلة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن نطاقات كثافة جانب الرابط في التجارب الأولى تهدف إلى جعل تكرار الالتصاق في النطاق المتوسط، وتذكر أن العمل مع الدم وبعض الكواشف المخصصة لمعالجات معينة، مثل sodium azide وDMSO، قد يكون خطيراً للغاية. لذلك، يلزم اتخاذ احتياطات مثل القراءة الدقيقة لنشرات سلامة المواد (MSDS) الخاصة بالكواشف وارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.