الخلايا Refolding الفحص

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس البروتين داخل الخلايا المعتمد على المرافق ، وإعادة طيه بعد الصدمة الحرارية. باستخدام مراسل لوسيفيراز ، قم أولا بعمل خلايا مشدة مع بلازميدات تغطي جين مراسل لوسيفيراز والمرافق المعني. ثم قم بتقسيم الخلايا المنقولة لنقاط زمنية للتعافي في التصميم التجريبي.

في اليوم التالي ، صدمة حرارية للخلايا للحث على البروتين في التكشف. اسمح للتعافي باستعادة طي البروتين داخل الخلايا ، ثم قم بقياس نشاط مراسل لوسيفيراز. تقيس النتائج إعادة طي البروتين المعتمد على الوقت والمعتمد على المرافق بناء على مقايسة لوسيفيراز.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل اختبار إعادة الطي في المختبر ، هي إمكانية الحصول على قراءة فسيولوجية لتأثير المركبات أو البروتينات على نشاط المرافق. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج مجموعة واسعة من الأمراض مثل الأمراض التنكسية العصبية أو السرطان لأن المرافقين يلعبون دورا مهما في تطور هذه الأمراض. أولا ، قم بتسخين وسط الاستزراع ، PBS و trypsin إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.

اغسل مزرعة متجمعة من خلايا HEK 2 93 بخمسة ملليلتر من PBS. ثم ضع ملليلترا واحدا من التربسين الذي يحتوي على 0.025٪ EDTA ، وقم بتدوير اللوحة برفق لتوزيع التربسين بشكل متساو واحتضانها عند 37 درجة مئوية. رج اللوحة بشكل دوري للتحقق من انفصال الخلية.

الآن الدقة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسط DMEM كامل ونقلها إلى أنبوب صقر 50 ملليلتر. ثم تعداد الخلايا باستخدام لوحة مضادة بيكمان. الخلايا بطلاقة مشتركة تتراوح بين 60 و 70٪ تقريبا وتحتضن لمدة ست إلى ثماني ساعات.

موازنة الجين المتطرف, تسعة كاشف لدرجة حرارة الغرفة وكمية من المصل الوسط الخالي من المصل إلى 37 درجة مئوية. ماصة الوسط الخالي من المصل إلى أنبوبين من الأنابيب الآينورية. ثم أضف الكاشف التاسع الجيني المتطرف دون لمس حضن جدار أنبوب einor لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في غضون ذلك ، قم بإعداد خلطات تعداء 2D NA في الأنبوب الأول ، وأضف اليراع الفانيليا والتحكم في المتجهات الفارغة في الأنبوب الثاني. أضف اليراع الفانيليا والمرافق الجزيئي. أضف الحمض النووي إلى دوامة مزيج كاشف الإرسال واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

استمر في إضافة هذا المزيج إلى الخلايا المطلية واحتضنه لمدة 24 ساعة. احصد الخلايا المنقولة باستخدام خلايا بذور التربسين بطلاقة مشتركة من 60 إلى 70٪ في ستة ألواح آبار ، واتركها في الحاضنة طوال الليل. استنشق الوسط من الخلايا المنقولة.

ثم أضف ملليلترا واحدا من عازلة الصدمة الحرارية واحتضنه لمدة 30 دقيقة. لإيقاف تخليق بروتين Denovo ، أغلق الأغطية بشرائط باراكولاكل واحتضانها في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الآن قم بإزالة الطفيلي وضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة للتعافي في نقاط زمنية محددة.

احصد الخلايا واغسلها مرة واحدة في PBS للحصول على انفصال فعال لتحلل الخلية ، قم بتجميد حبيبات الخلية في النيتروجين السائل ، وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل السلبي المخفف. الآن aliquot في ثلاث نسخ. 30 ميكرولتر من محللات الخلية لكل بئر من لوح 96 بئر.

من أجل تقييم كفاءة التعدي ، ابدأ بالعينات المرجعية غير المصدومة. لقياس نشاط لوسيفيراز تشغيل ، قم بإعداد 0.2 مللي مولار لوسيفر طازج في المخزن المؤقت للتفاعل العازل gly Gly الذي يحتوي على واحد مليمولار A TP و 0.2 ميكرومولار عازل تفاعل ezine. أدخل لوحة البئر 96 في مقياس الإضاءة وابدأ البرنامج.

محطة عمل والاش 1420. أدخل المضخة واحدة في أنبوب فالكون الذي يحتوي على 0.2 ميكرومولار عازلة تفاعل ezine. اختر من القائمة ، خيار صيانة الموزع ، وقم باختيار مضخة واحدة.

حدد الخيار تعبئة لتحرير تخطيط اللوحة. حدد الخيار واستكشف البروتوكول والنتائج في القائمة. حدد البروتوكول.

الآن حدد الآبار المراد قراءتها. ارجع إلى مدير Wallach وانقر فوق ابدأ لقياس انبعاثات العينة. عند 482 نانومتر ، انتقل إلى صيانة الموزع وحدد فارغا وضخ واحدا لتحرير كل المحلول المتبقي مرة أخرى إلى الأنبوب.

الآن انقل الأنبوب إلى صقر يحتوي على الماء والقراد ، وقم بتدفقه. تابع عن طريق تحديد فارغ. ثم ضع الأنبوب من المضخة الأولى في المخزن المؤقت للتفاعل والأنبوب من المضخة الثانية في محلول LUCIFERIAN.

قم بتغيير تخطيط اللوحة. حدد تعبئة المضخة الأولى والمضخة الثانية. من قائمة صيانة الموزع ، حدد البروتوكول وابدأ في قياس الطول الموجي لتفاعل لوسيفيراز اليراع البالغ 560 نانومتر.

في نهاية التكرار ، كرر الإجراء ، فارغا ، دافق ، فارغ. بالنسبة للمضخة الأولى والمضخة الثانية ، اعرض النتائج في Wallach 1420 Explorer. ترتبط كل تجربة بفحص.

رقم اسم المستخدم يبدأ وتاريخ الانتهاء نتائج التصدير كملف Excel. للتحليل ، يرتبط إعادة طي البروتين ارتباطا مباشرا بوقت الاسترداد. في هذه التجربة ، يتم تقييم الخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد الصدمة الحرارية.

في غياب ووجود مرافق جزيئي. كما هو متوقع ، تزداد النسبة المئوية للوسيفيراز المعاد طيه مع وقت التعافي الطويل في كل من الضوابط والخلايا التي تم نقلها باستخدام المرافق الجزيئي. على النقيض من ذلك ، تعرض مجموعة البيانات غير الصالحة قيما مربعة R ضعيفة للارتباط بين الوقت وإعادة الطي.

باتباع هذه التقنية ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحص TPAs في المختبر من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تثبيط النشاط الأنزيمي للمرافق. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس البروتين داخل الخلايا. نحن نتابع بعد صدمة عقبة.