الخلايا Refolding الفحص

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس إعادة طي البروتين داخل الخلايا المعتمد على المرافقة (chaperone) بعد الصدمة الحرارية. باستخدام مراسل لوسيفيراز (luciferase reporter)، يتم أولاً نقل البلازميدات التي تحتوي على جين مراسل اللوسيفيراز والمرافقة المعنية إلى الخلايا. بعد ذلك، يتم تقسيم الخلايا المنقولة وفقاً لنقاط زمنية للاستعادة كما هو محدد في التصميم التجريبي.

في اليوم التالي، قم بتعريض الخلايا لصدمة حرارية لتحفيز تفكك طي البروتين. اترك الخلايا لفترة استشفاء لاستعادة طي البروتين داخل الخلايا، ثم قم بقياس نشاط مراسل اللوسيفيراز. تقيس النتائج إعادة طي البروتين المعتمدة على الوقت والمعتمدة على المرافقات الجزيئية بناءً على مقايسة اللوسيفيراز.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مقايسة إعادة الطي في المختبر (in vitro refolding assay)، في إمكانية الحصول على قراءة فسيولوجية لتأثير المركبات أو البروتينات على نشاط المرافقات الجزيئية (chaperones). وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل علاج مجموعة واسعة من الأمراض، مثل الأمراض التنكسية العصبية أو السرطان، نظرًا للدور الهام الذي تلعبه المرافقات الجزيئية في تطور هذه الاعتلالات. أولاً، قم بتدفئة وسط الزرع، ومحلول PBS والتريبسين مسبقاً إلى 37 °C في حمام مائي.

اغسل مزرعة متلاحمة من خلايا HEK 2 93 باستخدام خمسة ملليلترات من PBS. ثم ضع ملليلتر واحد من التربسين الذي يحتوي على 0.025%EDTA، وقم بتدوير الطبق بلطف لضمان توزيع التربسين بالتساوي، ثم حضن الطبق عند 37 درجة مئوية. قم برج الطبق بشكل دوري للتحقق من انفصال الخلايا.

الآن، أعد تعليق الخلايا في 10 milliliters من وسط DMEM الكامل وانقلها إلى أنبوب فالكون سعة 50 milliliter. بعد ذلك، قم بتعداد الخلايا باستخدام عداد Beckman. ازرع الخلايا بكثافة تبلغ حوالي 60 إلى 70% وحضنها لمدة ست إلى ثماني ساعات.

قم بموازنة درجة حرارة كاشف extreme gene nine لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، وموازنة الجزء المخصص من الوسط الخالي من السيروم ليصل إلى 37 درجة مئوية. انقل الوسط الخالي من السيروم باستخدام الماصة إلى أنبوبي einor. ثم أضف كاشف extreme gene nine دون ملامسة جدار أنبوب einor، واتركه للحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في هذه الأثناء، قم بتحضير مخاليط عفن النواة (NA) ثنائية الأبعاد في الأنبوب الأول، وأضف ran vanilla firefly ونواقل تحكم فارغة في الأنبوب الثاني. أضف ran vanilla firefly والمرافق الجزيئي. أضف الـ DNA إلى خليط كاشف عفن النواة، ثم قم بالرج الدوامي والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

استمر في إضافة هذا المزيج إلى الخلايا المزروعة وتحضينها لمدة 24 ساعة. يتم حصاد الخلايا المنقولة جينياً باستخدام التريبسين؛ حيث تُزرع الخلايا بكثافة تتراوح بين 60 إلى 70% في أطباق ذات ستة آبار، وتُترك في المحضنة طوال الليل. ثم يتم سحب الوسط من فوق الخلايا المنقولة جينياً.

بعد ذلك، أضف 1 mL من منظم صدمة الحرارة (heat shock buffer) واحضن العينة لمدة 30 دقيقة. ولإيقاف تخليق بروتين Denovo، قم بإغلاق الأغطية بشرائط البارافورم (paraform strips) واحضنها في حمام مائي بدرجة حرارة 45 °C لمدة 30 دقيقة. الآن، أزل البارافورم وأعد الخلايا إلى الحاضنة للاستشفاء في نقاط زمنية محددة.

قم بحصاد الخلايا وغسلها مرة واحدة في PBS. ولضمان تحلل خلوي فعال، قم بتجميد كتلة الخلايا بالتجميد السريع في النيتروجين السائل، ثم أضف 200 µL من منظم تحلل الخلايا الخامل المخفف. الآن، وزع العينات في مكررات ثلاثية، بمقدار 30 µL من ناتج تحلل الخلايا لكل بئر في لوحة ذات 96 بئراً.

من أجل تقييم كفاءة ترانسفكشن، ابدأ بالعينات المرجعية غير المعرضة للصدمة. لقياس نشاط لوسيفيراز ran، قم بتحضير محلول تفاعل طازج من Lucifer بتركيز 0.2 millimolar في منظم Gly Gly يحتوي على 1 millimolar من A TP و 0.2 micromolar من ezine reaction buffer. أدخل لوحة 96 well plate في جهاز luminometer وابدأ البرنامج.

محطة عمل Wallach 1420. أدخل المضخة الأولى في أنبوب Falcon الذي يحتوي على 0.2 micromolar من منظم تفاعل ezine. اختر من القائمة خيار صيانة الموزع (dispenser maintenance)، ثم حدد المضخة الأولى.

اختر خيار التعبئة لتعديل تخطيط الطبق. اختر الخيار، واستكشف البروتوكول والنتائج من القائمة. حدد البروتوكول.

الآن حدد الآبار المراد قراءتها. عُد إلى مدير Wallach وانقر على "بدء" (start) لقياس انبعاثات العينة. عند 482 نانومتر، انتقل إلى صيانة الموزع وحدد "تفريغ" (empty) و"ضخ واحد" (pump one) لإرجاع جميع المحاليل المتبقية إلى الأنبوب.

الآن، انقل الأنبوب إلى أنبوب فالكون يحتوي على الماء وقم بعملية شطف. استمر في ذلك عن طريق اختيار "فراغ" (empty). ثم ضع الأنبوب الخاص بالمضخة الأولى في محلول التفاعل المنظم (reaction buffer) والأنبوب الخاص بالمضخة الثانية في محلول LUCIFERIAN.

قم بتغيير تخطيط الطبق. اختر تعبئة للمضخة الأولى والمضخة الثانية. من قائمة صيانة الموزع، اختر البروتوكول وابدأ في قياس طول موجة تفاعل لوسيفيراز اليراعة 560 nanometers.

في نهاية عملية التكرار، كرر الإجراء: تفريغ، ثم شطف، ثم تفريغ. بالنسبة للمضخة الأولى والمضخة الثانية، اعرض النتائج في جهاز Wallach 1420 Explorer. ترتبط كل تجربة بمقايسة تحليلية.

أدخل اسم المستخدم وتاريخ البدء والانتهاء، ثم قم بتصدير النتائج كملف Excel. ولأغراض التحليل، ترتبط عملية إعادة طي البروتين ارتباطاً مباشراً بوقت التعافي. وفي هذه التجربة، يتم تقييم الخلايا عند نقاط زمنية مختلفة بعد الصدمة الحرارية.

في حالة غياب وبوجود المرافق الجزيئي. وكما هو متوقع، تزداد نسبة لوسيفيراز المعاد طيه مع زيادة وقت الاسترداد في كل من المجموعات الضابطة والخلايا التي تم نقل المرافق الجزيئي إليها. وفي المقابل، تظهر مجموعة البيانات غير الصالحة قيم R squared منخفضة للارتباط بين الوقت وعملية إعادة الطي.

بناءً على هذه التقنية، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل مقايسة TPAs في المختبر للإجابة على أسئلة إضافية مثل تثبيط النشاط الإنزيمي للمرافق البروتيني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس البروتين داخل الخلايا الذي نتبعه بعد الصدمة الحرارية.