Name: حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: تعلم زراعة الخلايا العصبية الودية من الجذع العنقي العلوي لفئران حديثة الولادة، وتحفيز نمو التغصنات باستخدام بروتين BMP-7 أو Matrigel. هذه الطريقة تتيح دراسة تطور الأعصاب وتشكيل الاتصالات العصبية بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعاهد الوطنية للصحة (منح R21 NS45037 وES014901 R01).

<ol><li>Purpura, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurpura%2C+DP+%22The+Neurosciences%3A+A+Study+Program%22">The Neurosciences: A Study Program</a>. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).</li>
<li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+changes+in+mammalian+sympathetic+neurons+following+interruption+of+their+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons.</a> J. Physiol. 252, 429-463 (1975).</li>
<li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurves%2C+D+%22A+Trophic+Theory+of+Neural+Connections%22">A Trophic Theory of Neural Connections</a>. , Harvard University Press. (1988).</li>
<li>Miller, J. P., Jacobs, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+neuronal+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Relationships between neuronal structure and function.</a> J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).</li>
<li>Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+specificity+and+long-term+information+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse specificity and long-term information storage.</a> Neuron. 18, 339-342 (1997).</li>
<li>Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+year+of+the+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The year of the dendrite.</a> Science. 275, 178-179 (1997).</li>
<li>Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+consequences+of+abnormal+cortical+development%3A+insights+into+developmental+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities.</a> Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).</li>
<li>Connors, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+mechanisms+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Neurology%22%5BJournal%5D)">Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders.</a> Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).</li>
<li>Pardo, C. A., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology+%28Zurich%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of autism.</a> Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).</li>
<li>Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurodevelopmental+disorders%3A+meeting+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse.</a> Science. 302, 826-830 (2003).</li>
<li>de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+and+dendritic+analysis+of+fascia+dentata+granule+cells+in+human+aging+and+senile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia.</a> Brain Res. 402, 217-229 (1987).</li>
<li>Flood, D. G., Coleman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+plasticity+in+normal+aging+and+decreased+plasticity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease.</a> Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).</li>
<li>Jagadha, V., Becker, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology%3A+an+overview+of+Golgi+studies+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man.</a> Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+I.+Conditions+under+which+neurons+form+axons+but+not+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites.</a> Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).</li>
<li>Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+promote+dendritic+development+in+rat+sympathetic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro.</a> Glia. 1, 380-392 (1988).</li>
<li>Lein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+extracellular+matrix+and+osteogenic+protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).</li>
<li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15, 597-605 (1995).</li>
<li>Lein, P. J., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+a+basement+membrane+extract+have+different+effects+on+axonal+and+dendritic+outgrowth+from+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro.</a> 136, 330-345 (1989).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).</li>
<li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-5+%28BMP-5%29+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li>
<li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+%28BMPs%29+and+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

من مزايا هذا النموذج ما يلي: (أ) وتتألف من ثقافات السكان متجانسة من الخلايا العصبية متعاطف خالية من أنواع الخلايا الأخرى 17،23، (ب) متطلبات عامل نمو الخلايا العصبية هي متعاطفة راسخة، والذي يسمح باستخدام تعريف المتوسطة، ومجموعة متنوعة من وسائل الاعلام تعريف، وركائز تعمل بشكل جيد لنمو الخلايا العصبية والحفاظ على متعاطف 23؛ (ج) الخلايا العصبية في هذه الثقافات استجابة بشكل موحد للنشاط التغصنات المعززة للمن Matrigel، BMP-7 وغيرها من أفضل الممارسات الإدارية الحزب ا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> زجاج coverslips </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 ساترة جولة مم # 1 السماكة، والزجاج الألمانية </td></tr><tr><td> عازمة طرف pipets </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> بولي-D-يسين </td><td> سيغما </td><td> P0899-100MG </td><td> الأسهم حل 1 ملغ / مل </td></tr><tr><td> الماء المقطر </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> غرامة لا ملقط دومون. 4 و 5 </td><td> أدوات العلوم الدقيقة (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20-قياس الإبر </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> ليبوفيتز لL-15 متوسطة </td><td> إينفيتروجن </tد&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز </td><td> ورثينجتون </td><td> 4176 </td><td> 1 ملغ / مل </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> روش </td><td> 04942078001 </td><td> 5 ملغ / مل </td></tr><tr><td> هانك في محلول ملحي متوازن (عن ولاية كاليفورنيا، ملغ) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM انخفاض الجلوكوز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-الجلوتامين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25030 </td><td> 20 ملي مول </td></tr><tr><td> الانسولين / ترانسفيرين / السيلينيوم </td><td> إينفيتروجن </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> الحمضية الدهنية الحرة BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> المنتجات الاحيائية هارلان </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> لحم الخنزير المتوسطة F-12 المغذيات (F-12) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11765 </td><tد&gt; </td></tr><tr><td> السيتوزين الأرابينوزيد </td><td> سيغما </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 356234 </td><td> تجنب تكرار تجميد ذوبان دورات </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D أنظمة Curis، المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> 345-BP-07H BMP7 </td><td> أفضل الممارسات الإدارية 4 و 5 و 6 العمل على قدم المساواة، وكذلك BMP-7، وتكون في بعض الأحيان أسهل من الحصول على تجاريا </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> سيغما </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> الصياد </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> ماوس لمكافحة الفئران MAP2 الأضداد </td><td> ستيرنبرغ Monoclonals المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> اليكسا فلور 546 الماعز المضادة للماوس </td><td> إينفيتروجن </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> تزايد وسائل الاعلام </td><td> إطالة المسابر عدة Antifade الجزيئية </td> &lt;TD&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. المواد

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

شكل شجرة شجيري يحدد مساهمة مجموع متشابك إحدى الخلايا العصبية يمكن أن تحصل 1-3، ويؤثر على أنواع وتوزيع هذه المدخلات و 4-6. وترتبط أنماط المتغيرة للنمو الشجيرية واللدونة وظيفة السلوك العصبي مع ضعف في نماذج تجريبية 7، ويعتقد أنها تساهم في الأعراض السريرية التي لوحظت في كل من اضطرابات النمو العصبي 8-10 وأمراض الاعصاب 11-13. هذه الملاحظات تؤكد أهمية الوظيفية للتنظيم على وجه التحديد مورفولوجيا شجيري، وتشير إلى أن تحديد الآليات التي تتحكم في نمو شجيري لن تقدم فقط فهم كيفية اتصال الخلايا العصبية وينظم خلال التطور الطبيعي، ولكن يمكن أيضا أن تقدم فكرة عن الاستراتيجيات العلاجية رواية عن الأمراض العصبية المختلفة. وسيتم دراسات الميكانيكية للنمو شجيري سهل إلى حد كبير من قبل س توفراتحاد كرة القدم النظام النموذجي الذي يسمح الخلايا العصبية تحول تجريبيا من الدولة التي لا تمتد إلى واحد في التشعبات التي وضع شجرة شجيري مماثلة لنظيراتها في الجسم الحي. الثقافات الأولية من الخلايا العصبية متعاطف فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من القوارض فترة ما حول الولادة تقديم مثل هذا النموذج. عندما زرعها في وسط المحددة في حالة عدم وجود الخلايا الدبقية المصل والعقدية، الخلايا العصبية متعاطف توسيع نطاق عملية واحدة التي هي محور عصبي، وهذه حالة القطب الواحد يستمر لأسابيع أو أشهر في ثقافة 14،15. ومع ذلك، فإن إضافة أي التخلق عظم بروتين-7 (BMP-7) 16،17 أو Matrigel 18 إلى ثقافة المتوسط ​​يطلق هذه الخلايا العصبية لتوسيع عمليات متعددة تلبي المورفولوجي، ومعايير الكيمياء الحيوية والوظيفية للالتشعبات. الخلايا العصبية متعاطف فصلها عن SCG من القوارض فترة ما حول الولادة، وتنمو في ظل ظروف محددة ويبلغ عدد سكانها متجانسة من الخلايا العصبية 19التي تستجيب بشكل موحد على النشاط التغصنات المعززة للمن Matrigel، BMP-7 وغيرها من أفضل الممارسات الإدارية decapentaplegic (النيابة العامة) و 60A تحت العوائل 17،18،20،21. الأهم من ذلك، Matrigel وBMP التي يسببها التغصنات تشكيل يحدث في حالة عدم وجود تغييرات في بقاء الخلية أو نمو محواري 17،18. هنا، نحن تصف كيفية إعداد الثقافات فصلها من الخلايا العصبية متعاطف المستمدة من SCG من الفئران قبل الولادة، بحيث تستجيب لنشاط التغصنات المعززة للانتقائية من Matrigel أو أفضل الممارسات الإدارية.

وصفنا على بروتوكول لاستخدام البروتين مخلق العظام-7 (BMP-7) أو Matrigel للحث على انتقائية نمو الخلايا العصبية الجذعية في متعاطف الابتدائية فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من الفئران قبل الولادة.

يحدد شكل التشجر الشجيري إجمالي المدخلات التشابكية التي يمكن أن تستقبلها العصبونة 1-3، ويؤثر على أنواع هذه المدخلات وتوزيعها...

الهدف من هذا الإجراء هو استزراع العصبونات الودية لتمكين التحكم في نمو الزوائد الشجرية الخاصة بها. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل العقد الرقبية العلوية من صغار القوارض في فترة ما حول الولادة تحت ظروف معقمة. وتتمثل الخطوة الثانية في تفكيك العقد لتشكيل معلق خلوي أحادي يتم زرعه على الركائز المُجهزة.وسط محدد يتكون من (Inde). بعد ذلك، وبعد معالجة المزارع بمادة مضادة للانقسام الخلوي للتخلص من الخلايا غير العصبية، تُعالج المزارع ببروتينات Morphogenetic Proteins العظمية (BMPs) أو مادة matrigel لتحفيز نمو الزوائد الشجيرية. وفي النهاية، يُستخدم تفاعل MAP2 المناعي لإظهار الزوائد الشجيرية الممتدة للعصبونات الودية المستزرعة.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المزرعة الأولية للعصبونات الحصينية، في إمكانية التحكم في الحالة المورفولوجية لعصبونات DYS بحيث يكون لدى أقل من 5% من العصبونات في المزرعة شجيرات، أو تظهر أكثر من 95% من العصبونات في المزرعة نمواً محورياً قوياً. لتحضير المزارع المرتبطة بـ SCG من صغار الجرذان في المرحلة الجنينية من اليوم 19 إلى 21، قم أولاً بحلق بطن جرذ حامل تم قتله رحيماً، ثم نظف الجلد بـ 70% ethanol، وبعد ذلك قم بإزالة قرون الرحم تحت ظروف معقمة مع تجنب إتلاف الأمعاء أو الأعضاء الداخلية الأخرى. ضع قرون الرحم في طبق بيتري معقم بقطر 150 millimeter. بعد ذلك، انقل طبق البيتري إلى وعاء يحتوي على ثلج.لتخدير الأجنة تمهيداً لقتل الرحمة، يتم قطع الحبل الشوكي على طول الخط الناصف أسفل الكتف. يؤدي هذا أيضاً إلى قطع الوريد الأجوف، مما يقلل من النزيف من الشريان السباتي. أثناء تشريح العقدة العصبية الرقبية العلوية (SCG)، توضع الأجنة في وسط Leibovitz's L 15 معقم ومضاف إليه البنسلين والستربتومايسين. ثم تُنقل الأجنة إلى أطباق بتري بقطر 150 مليمتر، مملوءة جزئياً بمادة Silgard، وتوضع على ظهورها.استخدم إبر معقمة بمقاس 20 gauge لتثبيت الصدر والرأس مع بسط الرقبة بلطف لتسهيل تشريح SCG تحت المجهر. قم بإجراء شق في خط المنتصف على طول الرقبة عند مستوى الترقوتان للكشف عن الغدد تحت الفكية. قم بإزالة الغدد باستخدام ملقط دقيق من أجل كشف الطبقة العضلية.بعد ذلك، اقطع العضلة القصية الترقوية الخشائية بالقرب من الترقوة، مع رفع العضلة اللامية اللامية بلطف بجوار الرغامي. هذه العضلة رقيقة جداً، لذا تجنب القطع بعمق زائد، مما قد يؤدي إلى تمزق الشريان السباتي والعقدة الرقبية العلوية (SCG) الكامنين تحتها. وبمجرد إزالة هذه الطبقات العضلية، يجب أن يصبح الشريان السباتي والعصب المبهم مرئيين بوضوح.يقع العقدة العنقودية العلوية (SCG) أسفل تفرع الشريان السباتي مباشرةً. قم بتشريح الأنسجة بعيداً عن كلا جانبي الشريان السباتي باستخدام ملقط دقيق من أجل كشف العقدة. بعد ذلك، استخدم ملقطين دقيقين للإمساك بالشريان السباتي فوق وتحت العدستين المنقارية والحبلية للعقدة العنقودية العلوية (SCG) على التوالي.لإزالة الجزء من الشريان السباتي الواقع فوق العقدة العنقودية العلوية (SCG) بالإضافة إلى العقدة نفسها، فمن المرجح أن يتم في هذه الخطوة أيضاً إزالة العقدة المشنقة، التي تقع إلى جانب الـ SCG في هذه المرحلة من النمو. ضع النسيج الذي تم تشريحه في طبق زراعة معقم بقطر 35 مليمتر يحتوي على وسط L 15 ومضادات حيوية. بعد ذلك، قم بإزالة الـ SCG من جميع الجراء قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.بعد ذلك، افصل العقدة العنقودية العلوية (SCG) برفق عن الشريان السباتي وأي أنسجة أخرى. قم بإزالتها أثناء التشريح. ثم انزع المحفظة من العقد.بعد ذلك، انقل العقد العصبية إلى طبق معقم آخر بقطر 35 مليمتر يحتوي على وسط L 15. ولتفكيك العقد العصبية الصدرية العلوية (SCG)، قم بإزالة وسط L 15. واستبدله بمحلول الكولاجيناز المذاب في محلول هانكس المتوازن للأملاح الخالية من الكالسيوم والمغنيسيوم.ثم يتم تحضينه عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد ذلك، يتم نقل SCG إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر. يتم إكمال الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام L 15 المدعم بـ BSA بتركيز نهائي يتراوح من واحد إلى اثنين ملليجرام لكل ملليلتر.قم بإجراء الطرد المركزي عند 200 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، تخلص من السائل الطافي واغسل العينة مرة أخرى باستخدام وسط L 15 المدعم بـ BSA بعد الغسلة الثانية. قم بإزالة وسط L 15 وأعد تعليق العقد في 2 مل من وسط الاستزراع.قم بتوزيع الخلايا في الوسط حوالي ثلاث إلى أربع مرات باستخدام ماصة ذات طرف منحني ومصقول باللهب. تأكد من تغطية الماصة بـ BSAL 15 قبل التوزيع لتقليل التصاق الخلايا بالزجاج. اترك التجمعات الكبيرة تترسب لمدة دقيقة واحدة تقريبًا، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.أضف بعد ذلك المزيد من الوسط الزرعي إلى الـ SCG المتبقية وقم بالقيام بعملية التثليث (tri) مجدداً. بعد استقرار الكتل، انقل معلق الخلايا من التثليث الثاني إلى المعلق الذي تم جمعه بعد التثليث الأول. كرر هذه العملية عدة مرات حتى يتم تفكك العقد العصبية في الغالب.تخلص من أي تكتلات متبقية بعد عملية التثليث الرابعة للخلايا المفصولة من لتر واحد من جراء الجرذان، ويجب إيصال الحجم الإجمالي للوسط في معلق الخلايا إلى 8 إلى 10 milliliters. من خلال إضافة وسط استزراع إضافي، قم بإعادة تعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة. ثم اجمع كمية صغيرة لتحديد كثافة الخلايا.قم بتعديل حجم معلق الخلايا من أجل تحقيق ضعف كثافة الخلايا المطلوبة في المزرعة. بعد ذلك، قم بتوزيع 250 µL من معلق الخلايا في كل بئر. وبالنسبة للدراسات المورفومترية لنمو التغصنات، نقوم عادةً بزراعة الخلايا في أطباق ذات 24 بئراً بكثافة منخفضة، حوالي 5 × 10⁴ خلية لكل بئر.بعد ذلك، ضع مستنبتات SCG على طبق تجفيف خزفي داخل مجفف زجاجي يحتوي على ماء معقم. احقن ما يقرب من 120 milliliters من ثاني أكسيد الكربون في المجفف قبل إغلاقه بإحكام. بعد ذلك، ضع المجفف بالكامل في حضانة واضبط درجة الحرارة على 35.5 degrees Celsius.في هذا الإجراء، يتم تغذية المزرعة عن طريق استبدال نصف الوسط الغذائي بعد 24 ساعة من الزراعة، وتكرار ذلك ثلاث مرات أسبوعياً للتخلص من الخلايا غير العصبونية من المزرعة. وعادةً ما يُضاف العامل المضاد للانقسام الفتيلي، RRC بتركيز يتراوح من 1 إلى 2 µM إلى الوسط الغذائي للمزرعة في هذا الوقت.بعد ذلك، أضف وسط زراعة حديث يحتوي على RSC إلى كل بئر، واتركه في الحضانة لمدة 48 ساعة لتحفيز نمو التغصنات بعد القضاء على الخلايا غير العصبية وانخفاض مستوى RSC بشكل ملحوظ. أضف matrigel أو BMP seven إلى وسط الزراعة في اليوم الخامس. ثم قم بتغذية المزرعة في المختبر (In vitro) كما وصفنا سابقاً؛ ويظهر هنا عصبون نما تحت ظروف التحكم مع نقص في التغصنات، وهو ما يتضح من غياب النتوءات الإيجابية المناعية لـ MAP two.في المقابل، فإن هذا العصبون، الذي تعرض لـ BMP seven، يمتلك عدة تغصنات مستدقة إيجابية المناعة لـ map two كما هو موضح هنا. يتم استنبات العصبونات الودية لمدة خمسة إلى سبعة أيام قبل معالجتها بـ BMP seven، ومن ثم تُعالج بـ BMP seven بتركيز 30 to 50 ng/mL لمدة يومين. لاحظ بداية النمو الشجري.تُنمى المزارع لمدة تتراوح من سبعة إلى 14 يومًا في غياب bmp.Seven. وتستمر في إظهار نمو محورى فقط، بينما تُظهر المزارع المعالجة بـ BMP.Seven بتركيز 30 إلى 50 نانوجرام لكل ملليلتر لمدة تتراوح من سبعة إلى 14 يومًا نموًا مختلفًا.تظهر نمواً شجيرياً قوياً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية عزل SCG. قم بتحضير مستنبت مفكك من العصبونات الودية لدراسات التشكل العصبوني ومعالجة النمو الشجيري تجريبياً.

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

هذا هو بروتوكول تصف كيفية عزل الخلايا العصبية والثقافة متعاطفة الأساسي من العقد العنقية العليا (SCG) من الفئران الوليدة الوليد.

بروتوكول للالخلايا العصبية التثقيف تعاطفية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (SCG)

وقد حددت الدراسات التي أجريت مؤخرا العديد من الطفرات في البروتينات المرتبطة متشابك أمراض الدماغ. الابتدائية العصبونات القشرية مثقف توفر مرونة كبيرة في دراسة الآثار المترتبة على هذه البروتينات المرتبطة بمرض في العمود الفقري شجيري التشكل والحركة.

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

&lt; p class = "jove_content"&gt;يوضح هذا الفيديو طريقة في المختبر لتوليد الخلايا العصبية المتعاطفة بعد العقدة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs). يتم تمايز hPSCs إلى خلايا قمة عصبية (NCCs) على دعم مصفوفة غشاء القاعدي باستخدام وسيط تمايز. ثم يتم فصل NCCs وتشكيلها في كرويات باستخدام وسيط تمايز آخر. أخيرا ، يتم تحويل الكرات إلى خلايا عصبية متعاطفة بعد العقدة باستخدام وسيط خلية عصبية متعاطفة.

توليد الخلايا العصبية الودية بعد العقدة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

يوضح الفيديو الزراعة المشتركة للخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG) مع خلايا Schwann. تزرع الخلايا العصبية DRG لأول مرة على غشاء ممتد مسبقا لنمو المحور العصبي المحاذاة. ثم يتم إدخال خلايا شوان ، والتي ترتبط بالمحاور ، وعزلها وتعزز بقاء الخلايا العصبية ووظيفتها.

الزراعة المشتركة لخلايا شوان مع الخلايا العصبية DRG على غشاء ممتد مسبقا

يوضح هذا الفيديو استخدام الخلايا العقدية الجذرية الظهرية المنقولة لدراسة إطلاق الناقل العصبي عن طريق تحفيزها باستخدام ناهض مستقبلات الببتيد العصبي.

تحفيز الخلايا العصبية الحسية العقدية الجذرية الظهرية باستخدام ناهض مستقبلات الببتيد العصبي

ويقدم البروتوكول الحالي إجراءات تجريبية لحفز الضامة مثقف أن تتمتع بالقدرة على إطلاق سراح الجزيئية العوامل التي تعزز ثمرة نورت. علاج مخيم إلى ثقافات المشارك العصبية-بلعم يستحث الضامة لإنتاج مكيفة المتوسطة التي تمتلك قوي نورت ثمرة النشاط.

بلعم العصبية الثقافات المشارك لتفعيل الضامة إفراز العوامل الجزيئية مع نشاط ثمرة نورت

نحن نصف العزلة والتشتت والطلاء من الخلايا الأولية لب الأسنان (DP) مع الخلايا العصبية ثلاثية التوائم (TG) المستزرعة فوق مرشحات عبر ويل فوق. يمكن تحليل الاستجابات الخلوية لخلايا DP مع الفلور المناعي أو تحليل الحمض النووي الريبي / البروتين. الفلور المناعي من علامات الخلايا العصبية مع المجهر المعالبؤر يسمح تحليل استجابات نمو النيوتر.

طريقة الثقافة المشتركة لدراسة النيرايت الناء في الاستجابة لإشارات اللب الأسنان باراكرين

في هذا البروتوكول، ونحن نصف مستقرة، استراتيجية تمايز عالية الكفاءة لتوليد الخلايا العصبية متعاطفة ما بعد ganglionic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية. هذا النموذج سيجعل الخلايا العصبية المتاحة لاستخدام الدراسات من اضطرابات غير ذات سيادة متعددة.

تمايز فعال من الخلايا العصبية المتعاطفة Postganglionic باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت ظروف الثقافة خالية من التغذية والمحددة كيميائيا

تصف هذه الورقة عزلة واستزراع الخلايا العصبية المتعاطفة مع الفئران الجنينية من العقدة العنقية المتفوقة. كما يوفر بروتوكولات مفصلة للتلوين المناعي الكيميائي وإعداد مقتطفات الخلايا العصبية لتحليل الطيف الشامل.

زراعة الجرذ المتعاطفة العصبية من الجنينية الجنينية الجنينية عنق الرحم العصبية لتحليل مورفولوجية وبروتيومية

تعلم زراعة الخلايا العصبية الودية من الجذع العنقي العلوي لفئران حديثة الولادة، وتحفيز نمو التغصنات باستخدام بروتين BMP-7 أو Matrigel. هذه الطريقة تتيح دراسة تطور الأعصاب وتشكيل الاتصالات العصبية بدقة.

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

استكشف المزيد من الفيديوهات