كشف وعزل خلايا الميلانوما تعميم استخدام Flowmetry الضوئي

الهدف من التجربة التالية هو الكشف عن وجود السرطان قبل تكوّن الأورام الثانوية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الحصول على عينات دم من مرضى الميلانوما في المرحلة الرابعة وفصلها. وفي خطوة ثانية، يتم إدخال الدم في غرفة تدفق صوتية ضوئية، مما يسمح بالكشف عن خلايا الميلانوما وعزلها.

بعد ذلك، يتم تصوير الخلايا المُلتقطة للتأكد من وجود الورم الميلانيني المكتشف. وتُظهر النتائج قدرة النظام على اكتشاف وعزل خلايا الورم الميلانيني بدقة وسرعة استناداً إلى أشكال الموجات الصوتية الضوئية وتقنيات تصوير الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لتقنيتنا مقارنة بالطرق الحالية التي تكتشف خلايا الورم الميلانيني الدوارة، مثل R-T-P-C-R، والفرز المغناطيسي للخلايا الحيوية وطرق أخرى، في أن طريقتنا خالية من الوسوم، وتسمح بالتقاط خلايا الورم الميلانيني الدوارة دون تغيير سطحها أو تثبيتها على ركيزة.

لتحضير عينة للكشف عن السرطان النقيلي، ابدأ بسحب 10 milliliters تقريباً من الدم الكامل من مريض سرطان في المرحلة الرابعة. في أنبوبي vacutainer سعة خمسة milliliter، قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة 10 دقائق. عند سرعة 3000 RPM، ستنفصل عينة الدم إلى ثلاث طبقات مختلفة، حيث تتكون الطبقة السفلية من كريات الدم الحمراء.

تحتوي الطبقة الوسطى، والتي تسمى أيضاً الطبقة الكريموية (buffy coat)، على الكريات البيضاء وخلايا الميلانوما، بينما تحتوي الطبقة العليا على البلازما والصفائح الدموية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من البلازما دون المساس بالطبقة الكريموية. أضف 250 µL من his opaque 10 77 إلى أنابيب troop سعة 2 mL.

باستخدام ماصة باستور بطول تسع بوصات، اسحب ما تبقى من البلازما، وطبقة الغشاء الأبيض (Buffy coat) بالكامل، والطبقة العلوية من الكريات الحمراء. مع التأكد من جمع كمية أقل من 500 µL. انقل المحلول إلى أنابيب وين تروب (wind Trobe) التي تم تحضيرها مسبقاً.

سوف ينفصل الدم مرة أخرى، ولكن هذه المرة ستنفصل الكريات الحمراء بواسطة hispa، مما يسمح باستخلاص الطبقة البيضاء (Buffy coat) بسهولة. استخدم ماصة Pesa بطول تسعة بوصات لعزل الطبقة البيضاء بالكامل ووضعها في أنبوب eend orph سعة 2 milliliter. ثم قم بتعليقها في 1.5 milliliter من PBS مع 2%volume per volume بين 20.

لبناء غرفة التدفق، ابدأ باسطوانة أكريليك بطول 8 ملم، بقطر خارجي يبلغ 20 ملم وقطر داخلي يبلغ 17 ملم. بعد ذلك، قم بحفر ثلاث فتحات بقطر 5 ملم عبر جانب الاسطوانة بزوايا 90 درجة عن بعضها البعض. ثم قص ثلاث قطع من الأنابيب البوليمرية وضعها في الفتحات المحفورة.

قم بمد غشاء البارافيلم عبر الجزء السفلي من الحلقة الأكريليكية لإنشاء سدادة مانعة لتسرب الماء. سيشكل البارافيلم وعاءً ضحلاً مع الحلقة الأكريليكية لاحتواء محلول الأكريلاميد الذي سيشكل غرفة التدفق. قم بتعليق سلك بقطر 1.6 millimeter عبر قطعيات الأنابيب المتقابلة مباشرة، مع التأكد من أن السلك وحده هو المرئي من خلال منتصف الحلقة وصولاً إلى قطعة الأنبوب الثالثة.

أدخل سلكاً بقطر 1.6 مليمتر وضع الأنبوب على مسافة مليمتر واحد من السلك المعلق. تمنع هذه الأسلاك مادة acrylamide من الدخول إلى الأنابيب. قم بتحضير خمسة مليمترات من acrylamide.

بعد ذلك، صب الخليط بسرعة في الحلقة الأكريليك، مع ملئه حتى الأعلى. وبعد بضع ثوانٍ، سيتجمد المحلول ويتحول إلى هلام. ولإنشاء قالب حجرة التدفق، اسحب الأسلاك بعناية مع الحرص على عدم تعكير هلام الأكريلاميد، مما يترك مسار تدفق أسطوانياً ومكاناً لوضع ليف بصري مُركز على مسار التدفق.

أصبحت غرفة التدفق الآن جاهزة للاستخدام صوتياً باستخدام هلام الموجات فوق الصوتية. قم بتوصيل محول طاقة صوتي بيزو-كهربائي من فلوريد متعدد فينيليدين بغرفة التدفق مباشرة فوق مسار التدفق. وباستخدام موصل بايونيت أو كابل BNC، قم بتوصيل محول الطاقة بمدخل مستقبل واسع النطاق.

قم بتوصيل مخرج المرشح بجهاز راسم الإشارة (oscilloscope) لتفعيل إشارة البدء (trigger). ضع صماماً ثنائياً ضوئياً (photo diode) بالقرب من المحول، واستخدم كابل B NNC لتوصيله بجهاز راسم الإشارة. اسحب الأنبوب الصغير الخاص بغرفة التدفق حتى تتشكل جيب هوائية صغيرة، ثم قم بتوصيله بالمحول.

بعد ذلك، أدخل الليف البصري واملأ التجويف بالماء لتقليل إشارات الواجهة وزيادة كمية ضوء الليزر المسلط على مسار التدفق. ونظراً للفتحة العددية لليف البصري والمسافة القصيرة إلى مسار التدفق، فإن الليزر سيشع فقط على سدادة واحدة من العينة في أي وقت محدد، مما يضمن أن العينة الموجودة مباشرة أمام الليزر هي ذاتها العينة التي تولد الإشارات الصوتية الضوئية.

بعد ذلك، قم بتوصيل وصلة على شكل حرف T بأحد أذرع غرفة التدفق، ووصل مضختي محاقن بالفروع الأخرى للوصلة. تحتوي إحدى المحاقن على الهواء بينما تحتوي الأخرى على معلق الخلايا الذي تم تحضيره مسبقاً. ثم ابدأ بتشغيل كلتا مضختي المحاقن.

عندما تصل السوائل المسموح بها إلى الوصلة على شكل حرف T، سيتم تقسيمها إلى سدادات متجانسة وتتدفق عبر المحول. قم بتسليط نبضات ليزر نانوثانية على العينة المتدفقة لتوليد موجات صوتية ضوئية في خلايا الميلانوما. وبما أن الميلانين ممتص بصري واسع النطاق، فيمكن استخدام أي طول موجي مرئي لليزر.

تشير الإشارة التي تظهر على راسم الإشارات (oscilloscope) عند وجود البزاقة فوق المحول إلى أن البزاقة تحتوي على ميلانوما. تتبعها عبر النظام قبل إسقاطها في قارورة تجميع. ولتحضير العينات للفحص الكيميائي النسيجي الخلوي المناعي، ضع شرائح زجاجية في أقماع الطرد المركزي الخلوي، ثم حمّلها في جهاز الطرد المركزي الخلوي (cyto spin) للمساعدة في تثبيت الخلايا الملتقطة على الشرائح الزجاجية.

ضع 100 µL من 1% BSA في PBS في كل قمع. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 600 RPM لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي، أضف عينات الخلايا إلى أقماع CyTOF، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 600 RPM لمدة ثلاث دقائق.

رش الشرائح بمثبت يعتمد على الإيثانول. ثم اغسل الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق مرتين لمنع الارتباط غير النوعي. قم بتحضين كل شريحة بخليط مكون من 10 µL من مصل الماعز و 90 µL من PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد التحضين، قم بتفريغ الشرائح وإضافة محلول الأجسام المضادة الأولية. يجب أن تحتوي كل شريحة على 1%rabbit mark، وواحدة 1%mouse CD 45، و10%goat serum في PBS، ثم تحضن لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.

بعد ذلك، تُحضن الشرائح في الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم تفريغ السوائل من الشرائح. ثم تُغسل في PBS لمدة خمس دقائق، ثلاث مرات، ولصب الأنوية، تُحضن الخلايا مع 0.1 micrograms per milliliter من DPI لمدة دقيقة واحدة. ثم تُفرغ السوائل من الشرائح وتُغسل في PBS.

أخيرًا، باستخدام وسط تثبيت قائم على الراتنج، يتم تثبيت غطاء شريحة فوق عينة الخلايا، ثم يُختم غطاء الشريحة بطلاء أظافر شفاف، وتُصوَّر العينة باستخدام مجهر فلوري. تظهر أشكال الموجات الصوتية الضوئية للخلايا البيضاء وخلايا الميلانوما هنا على اليسار. وبما أن الخلايا البيضاء لا تمتلك تصبغًا ذاتيًا، فإنها لا تنتج موجات صوتية ضوئية وتظهر كخط مسطح من الضوضاء الإلكترونية على اليمين.

ومع ذلك، تنتج خلايا الميلانوما المصبغة موجة صوتية ضوئية قوية. وبعد إجراء الصبغ المناعي الخلوي والصبغ الكيميائي، تظهر خلايا الميلانوما المستزرعة إشارات منقطة باللون الأزرق، مع تمييز خلية واحدة باللون الأخضر في الصور المتراكبة لـ DPI، وخلية أخرى بـ CD 45 كمؤشر على الكريات البيضاء. يوضح هذا الشكل خلايا الميلانوما من بين عدة كريات دم بيضاء بعد تطورها.

سوف تمهد تقنيتنا الطريق للباحثين في مجال الكشف عن السرطان لاستكشاف ظاهرة الانتشار الورمي، وذلك لتحسين الكشف عن السرطان وفي نهاية المطاف علاج انتشاره القاتل.