رصد بروتين الامتزاز مع الحالة الصلبة Nanopores

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مسام نانوية في الأغشية الاصطناعية لاستخدامها في دراسات امتصاص البروتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق حفر المسام النانوية في غشاء النيتريد باستخدام ساق. ثم يتم تحميل المسام النانوية في غرفة وتكون مبللة بمحلول أيوني.

لذلك يشكل هذا السائل جسرا من جانب واحد من المسام النانوية إلى الجانب الآخر لجعل المسام النانوية جاهزة للتجارب. يتم تطبيق جهد عبره ويمكن ملاحظة مرور تيار من الأيونات عبره. الخطوة الأخيرة هي إضافة البروتين إلى غرفة نانوبور.

في النهاية ، تكشف مراقبة الحصار طويل الأمد في التيار الأيوني عبر المسام النانوية عن امتصاص البروتينات على جانبي المسام النانوية. مرحبا ، أنا ديف ويكي. أنا طالب دراسات عليا في قسم الفيزياء بجامعة سيراكيوز.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لامتصاص البروتينات على الأسطح غير العضوية. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل البروتين وتفاعلات الحمض النووي والجزيء الفردي للتحليل الطيفي ودراسة الجزيئات في الأماكن الضيقة. ابدأ بإحضار الجذع إلى جهد تسارع.

التحميل التالي ، شبكة نافذة نيتريد السيليكون SPI في حامل عينة TEM. نظف الشبكة ببلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية لإزالة الحطام. قبل تحميل العينة ، قم بتحميل حامل العينة في TEM واترك الفراغ يضخ لأسفل.

باستخدام وضع brightfield TEM ، ابحث عن نافذة النيتريد ، وهي مربع ساطع على rogram الخام. تأكد من محاذاة TEM بشكل صحيح. ثم قم بمحاذاة العينة وتركيزها.

الآن ضع النظام في وضع STEM واستخدم كاشف إيقاف التشغيل السريع لتصوير العينة والتحقق من محاذاتها. اضبط أحادي اللون إذا كان موجودا على قيمة منخفضة ، مما يسمح بتيار أعلى من الإلكترونات المتاحة للحفر. حدد حجم البقعة المناسب لحفر نانوبور بناء على قطر مسبار الإلكترون.

مع محاذاة الجذع. استخدم BROGRAM للتركيز بشكل مثالي على غشاء النيتريد بالتكبير المطلوب. إذا كان هناك أي حركة للعينة ، فارغة ، شعاع الإلكترون وانتظر حتى تستقر العينة.

قد يستغرق ذلك ما يصل إلى ساعة. بمجرد الاستقرار ، ضع مسبار الإلكترون على العينة وابدأ في حفر المسام النانوية. يتطلب حفر المسام النانوية باستخدام TM خيانة المريض الزوجية.

إنها عملية يتبدد فيها النيتريد تدريجيا تحت مسبار شعاع الإلكترون. من المهم إبقاء مسبار الإلكترون فوق موقع الحفر مباشرة والتأكد من أن المسام النانوية محفورة بالكامل. قبل إزالة العينة من TEM ، تحقق بشكل دوري من العينة عن طريق المسح الضوئي باستخدام كاشف إيقاف التشغيل الساخن.

إذا انجرفت العينة قليلا ، فاضبط موضع مسبار الإلكترون ليكون فوق المسام النانوية. مع تركيز عائد الاستثمار ، سيختفي فيلم النيتريد المتلألئ. عندما تتشكل المسام النانوية مع الجرام الروكي خارج نطاق التركيز ، يكون هامش الظفر المكسور مرئيا.

قم بتصوير المسام النانوية مع إيقاف التشغيل الساخن وقم بعمل ملف تعريف شدة للصورة. يمكن تقدير قطر المسام النانوية من خلال أحلك منطقة في الملف الشخصي. يمكن استخدام مسبار الإلكترون لتكبير المسام النانوية إذا لزم الأمر.

عندما يكون لها القطر المطلوب. قم بالتبديل إلى وضع TEM باستخدام أحادي اللون في الإعداد القياسي. استخدم brightfield TEM لتأكيد حجم المسام.

ابدأ بتحضير ديغا دي سالين. ضع المحلول تحت الفراغ وفي سونيكات الحمام لمدة 20 دقيقة بدقة ، ضع رقاقة نانوبور الهشة التي تحتوي على نيتريد السيليكون في منقار بيركس سعة 10 مل. ثم في غطاء الدخان ، ضع الدورق على طبق ساخن.

قم بتنظيف شريحة Nanopore بعناية فائقة بمحلول سمكة البيرا. أولا ، أضف ثلاثة ملليلتر من حامض الكبريتيك إلى الحاوية باستخدام ماصة زجاجية. ثانيا ، أضف بعناية ملليلتر واحد من بيروكسيد الهيدروجين العالي إلى حمض الكبريتيك.

يرجى اتخاذ جميع الاحتياطات. اترك شريحة nanopore تنقع لمدة 10 دقائق. ثم باستخدام ماصة زجاجية ، قم بإزالة محلول سمكة البيرانا من الدورق وتخلص منه بشكل صحيح.

بعد ذلك ، املأ الدورق بالماء منزوع الأيونات. باستخدام ماصة زجاجية نظيفة ، أفرغ الدورق من الماء وكرر هذا الغسيل خمس مرات على الأقل. باستخدام ملاقط نظيفة ، قم بإزالة شريحة nanopore وجففها عن طريق الشفط الخفيف.

بمجرد أن تجف ، أغلق شريحة nanopor على الفور في الغرفة. يمكن تأمين الرقاقة في الغرفة بواسطة حلقات O أو مانع تسرب سيليكون. املأ الغرفة بمحلول كلوريد البوتاسيوم.

قم بتوصيل أقطاب كلوريد الفضة والفضة بالغرفة. يمكن صنع الأقطاب الكهربائية عن طريق نقع الأسلاك الفضية في المبيض طوال الليل. قم بتطبيق إمكانات عبر الغشاء عبر الأقطاب الكهربائية وراقب الاستجابة الحالية باستخدام مضخم مشبك التصحيح.

في وضع مشبك الجهد ، قم ببناء منحنى جهد تيار من القياسات. يجب أن يكون المنحنى خطيا للغاية. عند استخدام كلوريد البوتاسيوم المولي ، يجب أن يتوافق توصيل المسام النانوية مع قطره.

إذا لم يعرض المسام النانوية منحنى IV خطي ، فإن التوصيل منخفض جدا أو أن التيار المفتوح للمسام النانوية غير مستقر. يشير هذا إلى أن المسام النانوية ليست مرتبطة بشكل صحيح ويجب تكرار غسل البيها. من الضروري التأكد من وجود السائل داخل المسام النانوية.

إذا لم تتم هذه الخطوة بشكل صحيح ، فسيظهر التيار الأيوني عبر المسام النانوية ضوضاء كبيرة جدا وسيتم تقليل تقسيم البروتينات إلى المسام النانوية بشكل كبير. ابدأ بإضافة عينة منقاة من البروتين محل الاهتمام في الحمام الأرضي للغرفة. انتظر حتى تنتشر العينة تماما.

قم بتطبيق انحياز جهد جهد محتمل عبر الغشاء مع قطبية معاكسة لتلك الخاصة بالشحنة الإجمالية للبروتين قيد الدراسة. يجب أن تكون الإمكانات المطبقة البالغة 200 مللي فولت كبيرة بما يكفي للمراقبة. ستظهر معظم أحداث تحليلات البروتين على شكل انحرافات تيار عابر عن خط الأساس.

إذا لم يتم ملاحظة أي إشارة ، فقم بزيادة تركيز البروتين في الغرفة. تعمل الفولتية العالية على تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء والنيتريد. يمكن للمسام النانوية أن تتحمل عدة فولتات.

ستظهر امتصاص البروتين كتغييرات طويلة العمر في التيار الأساسي للمسام النانوية. ستكون النتائج النموذجية للمسام النانوية ذات الحالة الصلبة على النحو التالي. يجب أن يكون تيار المسام المفتوح مستقرا للغاية.

يجب أن تكون الخصائص الوريدية للمسام النانوية خطية للغاية. في كلوريد البوتاسيوم المولي ، 10 مولار فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 7.4 ، سيوفر ميل الملاءمة الخطية للمنحنى الرابع التوصيل الوحدوي للمسام النانوية. الموصلية لها علاقة مباشرة بقطر المسام النانوية ويجب أن تتطابق مع المعادلة.

يجب أن تتطابق هذه القيمة مع 30٪ إذا كانت القيمة صغيرة جدا ، فمن المحتمل ألا تكون المسام مرتبطة بإضافة البروتين. يجب أن تترتب على الأحداث السريعة امتصاص البروتين هو انخفاض تيار طويل العمر. بعض البروتينات شديدة القابلية للتغيير وتخضع لتحول هيكلي داخل المسام الداخلية.

في هذه الحالة ، سيكون انخفاض الجهد طويل الأمد مصحوبا بتقلبات سريعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع المسام النانوية ذات الحالة الصلبة باستخدام المجهر الإلكتروني لنقل المسح ، واستخدام امتصاص بروتين SA المتوازن. لا تنس أن العمل بمحلول سمكة الضاري المفترسة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان مع القفازات ومعطف المختبر والمئزر الكيميائي عند تنفيذ هذا الإجراء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.