رصد بروتين الامتزاز مع الحالة الصلبة Nanopores

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء ثقوب نانوية في أغشية اصطناعية لاستخدامها في دراسات امتصاص البروتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق حفر ثقوب نانوية في غشاء نتريد باستخدام ساق حفر. بعد ذلك، يتم وضع الثقب النانوي في غرفة وترطيبه بمحلول أيوني.

بحيث يشكل السائل جسراً من جانب واحد من المسام النانوي إلى الجانب الآخر لجعل المسام النانوي جاهزاً للتجارب. يتم تطبيق جهد كهربائي عبره، ويمكن ملاحظة مرور تيار من الأيونات من خلاله. والخطوة الأخيرة هي إضافة البروتين إلى غرفة المسام النانوي.

في نهاية المطاف، يكشف رصد حالات الحصر طويلة الأمد في التيار الأيوني عبر الثقب النانوي عن امتزاز البروتينات على جدران الثقب النانوي. مرحباً، أنا ديف ويكي، طالب دراسات عليا في قسم الفيزياء بجامعة سيراكيوز.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول امتزاز البروتينات على الأسطح غير العضوية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل التفاعلات بين البروتينات والأحماض النووية، ومطيافية الجزيء الواحد، ودراسة الجزيئات في المساحات المحصورة. ابدأ برفع الساق إلى جهد تسريع.

بعد ذلك، قم بتحميل شبكة نافذة من نتريد السيليكون من SPI في حامل عينات المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). نظف الشبكة باستخدام بلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية لإزالة الشوائب. قبل تحميل العينة، ضع حامل العينات في جهاز TEM واترك الفراغ ليتم تفريغه.

باستخدام وضع TEM للمجال المضيء، حدد نافذة النتريد، وهي عبارة عن مربع مضيء في البرنامج الخام. تأكد من محاذاة TEM بشكل صحيح. بعد ذلك، قم بمحاذاة العينة وتركيزها.

قم الآن بضبط النظام على وضع STEM واستخدم كاشفًا ساخنًا (hot off detector) لتصوير العينة والتحقق من محاذاتها. اضبط الموحد اللوني (monochromator)، في حال وجوده، على قيمة منخفضة، بما يسمح بتوفر تيار أعلى من الإلكترونات لعملية الثقب. اختر حجم البقعة (spot size) المناسب لثقب المسام النانوية (Nanopore) بناءً على قطر المسبار الإلكتروني.

عندما يتم محاذاة الساق، استخدم نظام BROGRAM لتركيز الرؤية بدقة على غشاء النيتريك عند التكبير المطلوب. في حالة حدوث أي حركة للعينة، قم بحجب شعاع الإلكترونات وانتظر حتى تستقر العينة.

قد تستغرق هذه العملية ما يصل إلى ساعة. بمجرد الاستقرار، ضع مسبار الإلكترونات على العينة وابدأ في حفر الثقب النانوي. يتطلب حفر الثقب النانوي باستخدام مجهر الإرسال (TM) صبراً ودقة عالية.

إنها عملية يتم فيها تبديد النتريد تدريجيًا تحت مسبار شعاع إلكتروني. ومن المهم الحفاظ على المسبار الإلكتروني مباشرة فوق موقع الحفر والتأكد من حفر الثقب النانوي بالكامل. وقبل إخراج العينة من المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، تحقق من العينة دوريًا عن طريق المسح باستخدام كاشف "hot off".

إذا انزاحت العينة قليلاً، قم بتعديل موضع مسبار الإلكترون ليكون فوق الثقب النانوي. وعندما يكون الـ ROI gram في بؤرة التركيز، سيختفي غشاء النتريد المتلألئ. وعندما يتشكل الثقب النانوي مع كون الـ roky gram خارج بؤرة التركيز، ستظهر حافة المسمار المهترئة.

قم بتصوير الثقب النانوي بينما يكون التسخين متوقفاً، ثم أنشئ ملفاً تعريفياً لشدة الصورة. يمكن تقدير قطر الثقب النانوي من خلال المنطقة الأكثر عتامة في الملف التعريفي. كما يمكن استخدام مسبار الإلكترونات لتوسيع الثقب النانوي إذا لزم الأمر.

عندما يصل القطر إلى القيمة المطلوبة، انتقل إلى وضع TEM مع ضبط الموحد اللوني (monochromator) على الإعداد القياسي. استخدم تقنية TEM بالمجال المضيء (brightfield TEM) للتأكد من حجم المسام.

ابدأ بتحضير محلول ملحي فسيولوجي منزوع الغاز. ضع المحلول تحت تفريغ هوائي وفي حمام سونيكات لمدة 20 دقيقة. ضع بعناية شريحة نتريد السيليكون الهشة التي تحتوي على الثقب النانوي في بيكر Pyrex سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك، ضع البيكر على لوح تسخين داخل خزانة استخلاص الغازات.

نظف شريحة Nanopore بعناية فائقة باستخدام محلول piranha. أولاً، أضف ثلاثة ملي لتر من sulfuric acid إلى الحاوية باستخدام ماصة زجاجية. ثانياً، أضف بعناية واحد ملي لتر من high hydrogen peroxide إلى sulfuric acid.

يرجى اتخاذ كافة الاحتياطات. اترك شريحة المسام النانوية (nanopore chip) لتنقع لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، وباستخدام ماصة زجاجية، قم بإزالة محلول بيرانا (piranha solution) من الكأس وتخلص منه بطريقة مناسبة.

بعد ذلك، املأ الكأس بالماء منزوع الأيونات والمزال منه الغازات (Degas). وباستخدام ماصة زجاجية نظيفة، أفرغ الكأس من الماء وكرر عملية الغسل هذه خمس مرات على الأقل. وبواسطة ملاقط نظيفة، أخرج شريحة الثقوب النانوية (nanopore chip) وجففها عن طريق الشفط الخفيف.

بمجرد أن تجف، قم بتثبيت شريحة الثقب النانوي فوراً داخل الغرفة. يمكن تأمين الشريحة في الغرفة باستخدام حلقات دائرية (O-rings) أو مانع تسرب سيليكوني. املأ الغرفة بمحلول كلوريد البوتاسيوم.

قم بتوصيل أقطاب الفضة وكلوريد الفضة بالغرفة. يمكن تحضير الأقطاب عن طريق نقع سلك فضة في مبيض لمدة ليلة كاملة. قم بتطبيق جهد عبر الغشاء على الأقطاب ومراقبة استجابة التيار باستخدام مضخم patch clamp.

في وضع تثبيت الجهد (voltage clamp mode)، قم بإنشاء منحنى العلاقة بين التيار والجهد من القياسات. يجب أن يكون المنحنى خطياً بدرجة كبيرة. عند استخدام كلوريد البوتاسيوم بتركيز 1 molar، يجب أن تتوافق موصلية الثقب النانوي مع قطره.

إذا لم يظهر النانوبور (nanopore) منحنى IV خطياً، فإن الموصلية تكون منخفضة جداً أو أن التيار المفتوح للنانوبور غير مستقر. يشير هذا إلى أن النانوبور لم يتم تثبيته بشكل صحيح، ويجب تكرار عملية الغسل بـ piha. ومن الضروري التأكد من وجود السائل داخل النانوبور.

إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح، سيتعرض التيار الأيوني عبر الثقب النانوي لضوضاء كبيرة جداً، وسينخفض توزيع البروتينات داخل الثقب النانوي بشكل حاد. ابدأ بإضافة عينة منقاة من البروتين المراد دراسته إلى الحوض المؤرض في الغرفة. انتظر حتى تنتشر العينة بشكل كامل.

قم بتطبيق جهد انحياز كهربائي عبر الغشاء بقطبية معاكسة لقطبية الشحنة الكلية للبروتين محل الدراسة. يجب أن يكون الجهد المطبق بقيمة 200 millivolts كافياً لإحداث ملاحظة. ستظهر معظم أحداث البروتينات المحللة على شكل انحرافات تيار عابرة عن خط الأساس.

في حال عدم ملاحظة أي إشارة، قم بزيادة تركيز البروتين في الغرفة. وتعمل الجهود الكهربائية الأعلى على تحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج والنيتريك. ويمكن للمسام النانوية أن تتحمل عدة فولتات.

ستظهر عمليات امتصاص البروتين كتغيرات طويلة الأمد في التيار القاعدي للمسام النانوية. ستكون النتائج النموذجية للمسام النانوية ذات الحالة الصلبة كما يلي: يجب أن يكون تيار المسام المفتوحة مستقراً للغاية.

يجب أن تكون خصائص الجهد والتيار (IV) للمسام النانوية خطية للغاية. وفي محلول كلوريد البوتاسيوم بتركيز 1 مولار، وفوسفات البوتاسيوم بتركيز 10 مولار عند pH 7.4، سيوفر ميل الملاءمة الخطية لمنحنى IV الموصلية الأحادية للمسام النانوية. وترتبط الموصلية بعلاقة مباشرة بقطر المسام النانوية ويجب أن تطابق المعادلة.

يجب أن تتطابق هذه القيمة في حدود 30%. إذا كانت القيمة صغيرة جداً، فمن المرجح أن المسام لم تلتحم مع إضافة البروتين. يجب أن تتبع ذلك أحداث سريعة، حيث يكون امتصاص البروتين بمثابة انخفاض طويل الأمد في التيار. بعض البروتينات تكون غير مستقرة للغاية وتخضع لتحول هيكلي داخل تجويف المسام.

في هذه الحالة، سيكون انخفاض الجهد طويل الأمد مصحوباً بتقلبات سريعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الثقوب النانوية ذات الحالة الصلبة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح النافذ، واستخدام تلك الثقوب لامتصاص بروتين SA. لا تنسَ أن العمل بمحلول البيرانا يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند تنفيذ هذا الإجراء، مثل العمل داخل خزانة استخلاص الأبخرة مع ارتداء القفازات، ومعطف المختبر، ومئزر كيميائي.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.