زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

توضع الخلايا المشتقة من القلب على أطباق زراعة الخلايا لمحاكاة نقص تروية القلب. ويتم تحقيق نموذج نقص التروية وإعادة التروية عن طريق وضع الخلايا لمدة 150 دقيقة في وسط خالٍ من الجلوكوز، بينما يكون مستوى الأكسجين أقل من 0.5%. وتؤدي فترة نقص التروية هذه إلى انكماش وتنفخ معظم الخلايا. بعد ذلك، يتم إعادة إدخال الأوساط الغذائية ومستويات الأكسجين الطبيعية لمحاكاة إعادة التروية.

تُضاف الخلايا الجذعية الميزنكيمية وتُزرع مع الخلايا التالفة. وبعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة، تُصبغ الخلايا بالكالسيوم وEthereum homodimer للتمييز بين الخلايا الحية والميتة؛ حيث يُظهر المجهر البؤري بوضوح مجموعتين من الخلايا وتفاعلاتهما. ويكشف تحليل قياس التدفق الخلوي عن ثلاث مجموعات من الخلايا التالفة، والتي يمكن تمثيلها بيانياً وتحليلها إحصائياً. إن بروتوكولات زراعة الخلايا الجذعية في طريقها للتطبيق في الممارسة السريرية، وينصب تركيز الأبحاث الحديثة على تحقيق نتائج أفضل، وجعل البروتوكولات أكثر متانة، وإيجاد مصادر جديدة للخلايا القابلة للزرع.

إن استقصاء فعالية العلاجات الخلوية ليس بمهمة سهلة، وهناك حاجة إلى أدوات جديدة للبحث في الآليات المشاركة في عملية العلاج. لقد صممنا بروتوكولاً تجريبياً للسماح بمراقبة الاتصالات الخلوية وحتى الآليات دون الخلوية أثناء نقص التروية، وإصابة التروية، وبعد زراعة الخلايا الجذعية. وتتمثل معايير التصميم لدينا في نظام مختبري بالكامل، بحيث لا يتواجد سوى الخلايا المضيفة والخلايا المانحة.

وبذلك يتم عزلها عن الأنسجة المحيطة. يتم قياس حيوية الخلايا بشكل مستمر قبل الإصابة وأثناءها وبعدها لمدة تصل إلى 24 ساعة. ويتم التحديد الدقيق لكلا المجموعتين من الخلايا بحيث يمكن تتبع مصير الخلايا المطعمة.

من أجل تحقيق هذا الهدف، قمنا بإعداد بروتوكول للحرمان من الأكسجين والجلوكوز، والذي يُرمز له اختصاراً بـ OGD، يليه فترة إعادة أكسجة. وقد وقع اختيارنا على خلايا C2 في اليوم التاسع كخلايا مضيفة، وهي سلالة خلوية معروفة من أرومات القلب الحمراء. وبعد عملية OGD، تم دعم الخلايا التالفة عن طريق زراعة خلايا جذعية ميزنكيمية مشتقة من نخاع العظم من خلال إضافتها إلى المزرعة.

سمح لنا هذا الإعداد باستقصاء الروابط بين الخلايا باستخدام المجهر البؤري والغابة المجهرية، وتقدير معدل بقاء الخلايا التالفة عن طريق قياس التدفق الخلوي. لنبدأ العمل ونرى كيف يتم ذلك. قم بإزالة وسط الزرع من خلايا H nine C two.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS واهضمها باستخدام 0.05%trypsin EDTA في أطباق بتري لمدة خمس دقائق. في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ثبط عمل trypsin باستخدام وسط استزراع DMEM. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 1200 RPM لمدة ثماني دقائق.

بعد إزالة السائل الطافي، أعد تعليق الخلايا في 1 mL من وسط زراعة DMEM، وقم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (cytometer) مع الصبغ بـ trypan blue. وزع 30,000 خلية H9C2 في كل بئر داخل لوحة زراعة ذات 12 بئراً، ثم ضع اللوحة في حاضنة CO₂ عند درجة حرارة 37 °C لمدة 24 ساعة. قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.

أضف 3 mm من الوسط الخالي من الجلوكوز. ضع الطبق في نظام تحضين الخلايا. ابدأ بتدفق غاز النيتروجين لتطهير نظام التحضين من الأكسجين.

انتظر حتى يصل مستوى الأكسجين إلى 0.5%، ثم ابدأ تشغيل الميقاتي. يمثل مستوى 0.5% من الأكسجين ضغطاً جزئياً يقدر بنحو ثلاثة مليمترات زئبق؛ قم بتعريض الخلايا لـ 150 دقيقة من نقص التروية المحاكى. خلال فترة نقص التروية، تبدأ الخلايا في الانفصال عن السطح وتظهر فقاعات على أغشيتها. وقد وجدنا أن كل مجموعة خلوية تتطلب فترات زمنية مختلفة قليلاً، وصولاً إلى تحقيق 60 إلى 80% من صور الخلايا.

لهذا السبب نقترح البدء بفترة حضانة R لمدة ساعتين. وإذا لم يكن ذلك كافياً، يتم زيادة وقت OGD. في حالتنا، تحتاج خلايا C two في عمر تسعة أيام عادةً إلى 150 إلى 170 دقيقة من OGD في نهاية محاكاة نقص التروية.

قم بإزالة الوسط الخالي من الجلوكوز من الخلايا، ثم أضف وسط استزراع عادي إلى الآبار باستخدام الماصة. ضع طبق الـ 12 بئراً لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 °C. تمثل هذه المرحلة فترة إعادة التروية.

أثناء محاكاة نقص التروية، قم بتحضير الخلايا المنقذة لغرض الزرع. خفف الصبغة الفلورية vibrant DID بنسبة 1 إلى 200 في وسط استزراع DMEM. اسحب الوسط من الخلايا المنقذة وأضف 300 µL من وسط DMEM المحتوي على vibrant DID في أطباق Petri لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 °C.

بعد مرور 30 دقيقة في نهاية إعادة التروية، أضف ألف خلية جذعية ميزنشيمية لكل بئر إلى الخلايا العضلية القلبية H9C2 بعد نقص التروية. الخطوات الأولية هي نفسها المستخدمة في استزراع خلايا H9C2، والتي تشمل الغسل مرتين بمحلول PBS، والمعالجة بالتريبسين، والعد. ضع المزرعة المشتركة من الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37°C لمدة 24 ساعة.

بعد مرور 24 ساعة، يتم جمع الوسط الزرعي والخلايا الملتصقة من الآبار باستخدام الماصة. ومن المهم جداً جمع الوسط الزرعي أيضاً لأن بعض الخلايا الميتة قد تكون قد انفصلت عن سطح طبق الزرع خلال فترة الحضن التي استمرت 24 ساعة.

قم بتعليق الخلايا في 500 µL من محلول live, dead, die، و5 nM من calcium، و400 nM من Ethereum homodimer في PBS بتركيز 5 × 10⁴ خلية/مل. وفي حالة المزارع المشتركة، يتم تمييز الخلايا الجذعية الميزنكيمية عن خلايا H9C2 عن طريق وسم الخلايا الفلوري الخاص بكل منهما. وبهذه الطريقة، يمكن الكشف عن اندماج الخلايا ومواقع التلامس بين خلية وأخرى.

يمكن تقييم نسبة الخلايا الميتة في أربعة حقول رؤية مستقلة، باستخدام عدسة شيئية بقوة 10 مرات لكل مستنبت بطريقة التعمية، مما يعطي نتيجة عد خلايا قابلة للتكرار. انقُل الخلايا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي. قم بتشغيل برنامج cell Quest Pro لضبط جهاز قياس التدفق الخلوي لإجراء القياس.

قم بتحضير عينات ضابطة من الخلايا الحية والميتة. يتم استزراع الخلايا الحية بنفس الكثافة في ظروف طبيعية وتُصبغ بالكالسيوم. أما الخلايا الميتة فتُحضّر بمعالجتها لمدة ساعة واحدة بـ 10 micromole من بيروكسيد الهيدروجين وتُصبغ بـ Ethereum homodimer، ثم تُجمع بنفس الطريقة. يجب ضبط إعدادات الجهاز بحيث تكون الخلايا الحية موجبة للكالسيوم وسالبة لـ Ethereum homodimer.

بينما تكون الخلايا الميتة سالبة للكالسيوم وموجبة للـ Ethereum homodimer، يمكن التعبير عن النسبة المئوية لهذه المجموعات كأعمدة في رسم بياني وإجراء تحليل إحصائي على هذه القيم. وقد وجدنا أن إضافة خلايا جذعية سليمة تزيد من نسبة الخلايا الناجية في المجموعة. ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا أيضاً أن الخلايا التي تم إنقاذها بعد الإصابة يمكن فصلها عبر البوابات (gated out) عن الخلايا الميتة، وكذلك عن تلك التي ظلت حية.

نحن نعتقد أن هذه الفئة تستحق المزيد من الاستقصاءات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب نقص التروية المحاكية مع زراعة الخلايا الجذعية في المختبر بطريقة معيارية. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم. في حال وجود أي استفسارات تقنية، لا تترددوا في التواصل معنا، وسنكون متواجدين للمساعدة.