تأكيد المسار الأيضي والاكتشاف من خلال ¹³ C - وضع العلامات من الأحماض الأمينية Proteinogenic

الهدف من هذا البروتوكول هو دراسة التمثيل الغذائي البكتيري باستخدام تحليل التمثيل الغذائي المدعوم بالكربون 13. في البداية، تُنمى الميكروبات في وجود ركائز كربونية مُعلمة، والتي يتم دمجها في البروتينات الميكروبية. بعد ذلك، يتم حصاد الميكروبات واستخلاص الأحماض الأمينية، ثم إجراء عملية التحلل المائي والاشتقاق لها.

تُطبق العينات على جهاز كروماتوغرافيا الغاز ومطياف الكتلة أو GCMS. ومن خلال تتبع مسارات انتقال الذرات بين المستقلبات في الشبكة البيوكيميائية، يمكن تحديد المسارات الأيضية الوظيفية التي يستخدمها الميكروب. أنا بيرت بورلا.

يمكن استخدام الطريقة التي نعرضها هنا كإضافة مكملة لعلم النسخ وعلم البروتوميات لتحديد المسارات الأيضية في الميكروبات. وقد استخدمنا هذه التقنية لاستقصاء الميكروبات التي تقوم بالبناء الضوئي، مثل السيانوبكتيريا، للبحث عن استخدام الكربون الميوتورفي أو غير ذاتي التغذية. في هذا الفيديو، سنستخدم ANOTHE 5 1 1 42 كسلالة نموذجية لتوضيح استخدام ركائز الكربون الموسومة لاكتشاف وظائف إنزيمية جديدة.

سأقوم أنا، ولي يو، وتشو يانغ فانغ بتوضيح هذا الإجراء. ابدأ هذا الإجراء بزراعة بكتيريا cyana thesei في وسط غير مُعلم. وعندما تصل البكتيريا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسطة، قم بتلقيح 3% من حجمها في الوسط المُعلم بالكربون 13.

ثم، ولتجنب إدخال كربون غير مُعلم من المزرعة الفرعية لللقاح الأولي إلى الوسط المُعلم نفسه في مرحلة النمو اللوغاريتمية المتوسطة، وعندما تصل بكتيريا Cy Thesei المُعلمة بالكربون 13 إلى مرحلة النمو اللوغاريتمية المتوسطة، يتم حصاد 10 milliliters عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الراسب في 1.5 milliliters من حمض الهيدروكلوريك بتركيز ستة molar وانقله إلى قارورة زجاجية شفافة ذات غطاء لولبي خاصة بكروماتوغرافيا الغاز أو قارورة GC.

قم بتغطية القوارير ووضعها في فرن عند درجة حرارة 100 °C لمدة 24 ساعة لتحليل بروتينات الكتلة الحيوية مائياً إلى أحماض أمينية. ينتج عن التحلل المائي لكريات الكتلة الحيوية 16 من الأحماض الأمينية العشرين الشائعة؛ وبعد التحلل المائي، انقل محلول الأحماض الأمينية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل، ثم قم بالطرد المركزي عند 20,000 G لمدة خمس دقائق. بعد التحلل المائي، انقل محلول الأحماض الأمينية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل، ثم قم بالطرد المركزي عند 20,000 G لمدة خمس دقائق لترسيب الجزيئات الصلبة.

بعد عملية الطرد المركزي، يتم نقل السوائل الطافية إلى قوارير GC جديدة لإزالة الجسيمات الصلبة الموجودة في محلول التحلل المائي، وذلك لمنع دخولها إلى عمود GC. بعد ذلك، يتم تجفيف الأحماض الأمينية لجعلها متطايرة من أجل فصلها بواسطة الكروماتوغرافيا الغازية؛ قم بإذابة العينات المجففة باستخدام 150 µL من رباعي هيدرو الفوران THF و 150 µL من N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide.

قم بحضن جميع العينات في فرن بين 65 و 80 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة باستخدام كاشف الاشتقاق Acetamide, T-B-D-M-S. قم برج العينات باستخدام جهاز Vortex من حين لآخر للتأكد من ذوبان المستقلبات الموجودة في القارورة. قم بطرد العينات مركزياً عند 20,000 GS لمدة 10 دقائق، ثم انقل السائل الطافي إلى قارورات GC جديدة.

يجب أن يكون السائل الطافي محلولاً أصفر اللون ورائقاً. وتكون درجات حرارة جهاز GC على النحو التالي: التثبيت عند 150 °C لمدة دقيقتين، ثم الرفع بمعدل 3 °C في الدقيقة حتى الوصول إلى 280 °C.

ارفع درجة الحرارة بمعدل 20 درجة مئوية في الدقيقة وصولاً إلى 300 درجة مئوية، ثم ثبتها لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، وبالنسبة لعمود GC بطول 30 مترًا، اضبط تأخير المذيب (solvent delay) على خمس دقائق تقريبًا، ونطاق نسبة الكتلة إلى الشحنة بين 60 و 500. قم بتحليل العينات بواسطة GCMS باستخدام نسبة تقسيم (split ratio) تتراوح من 1:5 إلى 1:10، وحجم حقن يبلغ 1 ميكرولتر، وغاز حامل من الهيليوم بمعدل تدفق 1.2 ملليلتر في الدقيقة بعد انتهاء التشغيل.

قم بتحليل بيانات GCMS باستخدام برنامج Microsoft Excel. يوضح هذا الشكل زمن الاستبقاء لـ GC وقمم نسبة الكتلة إلى الشحنة الفريدة لكل حمض أميني. تتقسم الأحماض الأمينية المشتقة بـ T-B-D-M-S عادةً بوضوح بواسطة MS إلى شظيتين مشحونتين: الشظية M ناقص 57، والتي تحتوي على الحمض الأميني بالكامل، والشظية M ناقص 159، والتي تفتقر إلى مجموعة كربوكسيل ألفا للحمض الأميني في حالة الليوسين والآيسوليوسين.

تداخلت قمة M ناقص 57 مع قمم كتلية أخرى ناتجة عن التجزئة. ويمكن استخدام N ناقص 15 لتحليل كامل عملية وسم الأحماض الأمينية. كما يتم الكشف غالباً عن مجموعة F 3 0 2 في معظم الأحماض الأمينية، وهي تحتوي فقط على مجموعة الكربوكسيل ألفا الأولى وذرات الكربون الثانية في الهيكل الأساسي للحمض الأميني.

ومع ذلك، ونظراً لأن هذه القمة (Ms.Peak) غالباً ما تعاني من نسب ضوضاء إلى إشارة عالية، فإن F 3 0 2 لا يُوصى به للتحليل الكمي للتدفقات الأيضية. تؤدي عملية اشتقاق الأحماض الأمينية أو المستقلبات المركزية إلى إدخال كميات كبيرة من النظائر المسمى طبيعياً، بما في ذلك carbon 13 وoxygen 18 وsilicon 29 وsilicon 30. ويمكن تصحيح ضوضاء القياس الناتجة عن النظائر الطبيعية في طيف الكتلة الخام أو نظائره باستخدام برمجيات منشورة.

يتم تقديم بيانات الوسم النظيري النهائية في شكل كسور كتلية. على سبيل المثال، M zero و M1 و M two و M three و M four، والتي تمثل الشظايا التي تحتوي على صفر إلى أربعة ذرات كربون موسومة بالكربون 13 في السيانين. لا يحتوي 5 1 1 2 على إنزيم three anine ammonia lyase، الذي يحفز تحويل three anine إلى two keto butyrate في مسار تصنيع isle النموذجي.

وبناءً على ذلك، ومن أجل تحديد مسار الأيزولوسين في هذا الكائن الحي، تم استنبات سلالة cyana THESEI 5 1 1 42 في وسط ASP two مع 54 millimolar من الجلسرول، وحُللت بواسطة GCMS كما هو موضح في هذا الفيديو هنا. وتستخدم سلالة Cyana Thesei 5 1 1 4 2 الجلسرول المسمى في الموضع الثاني كمصدر رئيسي للكربون، وقد لاحظنا أن الثريونين والألانين، اللذين يُعد البيروفات سلائف لهما، يحتويان على ذرة كربون واحدة مسمى، بينما كان الأيزولوسين مسمى بثلاث ذرات كربون. وبالتالي، فإن تخليق الأيزولوسين في سلالة cyana Thesei 5 1 1 4 2 لا يمكن أن يكون مشتقاً من مسار الثريونين الذي تستخدمه معظم الكائنات الحية. ومن ناحية أخرى، أظهر اللوسين والأيزولوسين أنماط تسميم متطابقة بناءً على القطعة M minus 15 والقطعة M minus 1 59.

على سبيل المثال، أظهر النظير أو البيانات المستمدة من N minus 15 التي تحتوي على أحماض أمينية غير مجزأة وسمًا متماثلاً لكل من leucine و ISO leucine. وبناءً على ذلك، يجب أن يتم تخليق leucine و ISO leucine من نفس السلائف، وهي pyruvate و acetyl-CoA. وتتوافق هذه الملاحظة مع انتقال الكربون المسمى في مسار Citra malate لتخليق isle.

يمكن استخدام هذه الطريقة لاستقصاء عملية التمثيل الغذائي لمجموعة متنوعة واسعة من الميكروبات، وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذها من البداية إلى النهاية في غضون أسبوع واحد تقريبًا.