تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين

يهدف بروتوكول الارتباك الكتلي إلى تحديد نشاط ديميثيلاز اللايسين باستخدام مثيلة النظائر وقياس الطيف الكتلي المالدي أولا لإجراء تفاعلات إزالة الميثيل المحفزة بالإنزيم على الببتيدات التي تحتوي على اللايسين الميثيلي. ثم تقوم المخلفات بميثيل منتجات الببتيد لتفاعل ديميثيلاز كيميائيا مع الفورمالديهايد الديوتيرات لإنتاج ببتيدات ميثيلية بشكل موحد تتأين بنفس الطريقة بواسطة المالدي تشرع في تحديد كل نوع من أنواع الببتيد بقياس الطيف المتعدد إلى الكتلي وحساب التداخل النظائري. من أجل تحديد الكميات النسبية من un mono dye و trimm الببتيدات الميثيلية ، تحدد نتائج التواء الكتلي الكميات النسبية لكل منتج تفاعل ديميثيلاز بناء على التغيرات في الكتلة.

الميزة الأساسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل قياس الطيف الكتلي المتعفن الروتيني هي أن درجة الكتلة مسؤولة عن الاختلافات في التأين بين الببتيدات الميثيلية المختلفة. خطرت لنا فكرة هذا النهج لأول مرة عندما طورنا طريقة لقياس مستويات أستلة الهيستون باستخدام أنهيدريد الخل الثقيل نظائريا. يتمثل التحدي الذي يواجه هذه التقنية في استخراج بيانات منطقة الذروة ، والتي يمكن أن تكون معقدة بسبب تداخل مغلفات نظائر الببتيد.

بالنسبة لتفاعل ديميثيلاز ، تم الجمع بين 125 نانوغراما من ديميثيلاز اللايسين المؤتلف ، وإنزيم واحد مع 0.25 ميكروغرام من ثنائي ميثيل هيسون H البيوتينيلاتي ، وثلاثة ببتيد في حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر من محلول ديميثيلاز. قم أيضا بإعداد عينة تحكم تحتوي على 0.25 ميكروغرام من الببتيد بدون LSD إنزيم واحد يحتضن التفاعل وأنابيب التحكم لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. بجانب إعداد R ، تمزج حبتان مسامتان 20 ميكرون كميات متساوية من الخرز والميثانول.

ثم أضف 10 أحجام من حمض الفورميك TFA ، وأضف ثمانية ميكرولترات من الخرز المسامي إلى كل عينة وحركها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في هذه الأثناء ، قم بشرط اثنين من أطراف الرمز البريدي C 18. سحب العينات مرتين مع 20 ميكرولتر من 0.1٪ TFA أربع مرات مع 70٪ أسيتو نتريل 0.1٪ TFA ، وأربع مرات مرة أخرى مع 0.1٪ TFA.

بعد ذلك ، قم بتحميل العينتين على أطراف الرمز البريدي المكيفة. باستخدام ماصة ، ادفع مستوى الصوت عبر راتنج C 18. كرر حتى يتم دفع الحجم الإجمالي لكلتا العينتين من خلال أطراف الرمز البريدي.

ثم اغسل أطراف الرمز البريدي مرتين باستخدام 20 ميكرولترا من عينات الوهم 0.1٪ TFA في 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت الوهم ، واستمر في الجفاف تماما باستخدام مكثف فراغ سريع. أولا ، قم بتعليق العينة في 100 ميكرولتر من 50 ملليمولار من الفوسفات المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 7.4. ثم أضف ثمانية ميكرولترات من أمين ثنائي ميثيل التجويف و 16 ميكرولترا من الفورمالديهايد المنزل.

احتضان عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. كرر المثيلة المختزلة عن طريق إضافة ثنائي ميثيل لامين مملة وفورمالديهايد الديوتيرتي واحتضانها لمدة ساعتين. في المرة الثالثة ، أضف ثنائي ميثيل لامين ممل واحتضانه عند أربع درجات مئوية لمدة 15 ساعة.

قم بإخماد التفاعل ب 12.5 ميكرولتر من ثلاثية مولية واحدة. الرقم الهيدروجيني 7.4 استمر في الجفاف تماما باستخدام مكثف فراغ السرعة. أولا Resus ، قم بتعليق عينات تفاعل التحكم والديميثيلاز في 100 ميكرولتر من 50 ملليمولار من الفوسفات المخزن الهيدروجيني 7.4.

أضف الآن ثمانية ميكرولترات من الخرز المسامي إلى عينات التحكم وتفاعل ديميثيلاز واجمعها على أطراف مضغوطة كما هو موضح سابقا. مراوغة في حجمين ميكرولتر على لوحة عينة MALDI واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة حتى تتبلور. تابع تحليل العينات عن طريق قياس الطيف الكتلي.

افتح ملفات الطيف في برنامج العمل وقم بالتصدير إلى برنامج M over Z. تحقق كذلك من منتجات التفاعل عن طريق قياس الطيف الكتلي الترادفي. أولا ، حدد نسبة مساحة الذروة للكربون 13 درجة مئوية اثنين والكربون 13 درجة مئوية أربعة نظائر بالنسبة إلى ذروة النظير الأحادي لعينة التحكم.

استخدم هذه النسب المحسوبة لتحديد الكمية النسبية للببتيد الموجودة في كل تعديل. حالة عينة تفاعل ديميثيلاز. يمكن استخدام إنزيم LSD بشكل فعال في القياس الكمي للتعويج الشامل لإزالة ميثيل اللايسين.

نظرا لأن تفاعل التحكم لا يخضع للمثيلة الاختزالية ، فإنه يشير إلى الغلاف النظيري النموذجي لهذا الببتيد ، تحدد مناطق الذروة الناتجة نسب خلفية الببتيد الموجودة في الكربون 13 C اثنين والكربون 13 C أربعة. تسمح الحالات النظيرية ، ومناطق الذروة من الطيف الكتلي لتفاعل التحكم بالقياس الكمي للكمية النسبية للببتيد الموجودة في كل حالة تعديل. في تفاعل ديميثيلاز ، تحدد مناطق الذروة من تفاعلات التحكم والديميثيلاز 33.7٪ ثنائي ميثيل ليسين 4 42 0.3٪ أحادي ميثيل ليسين أربعة و 24٪ ليسين غير ميثيل أربعة.

يقدم نهج اللحشام الجماعي هذا رؤى رئيسية في مجال علم التخلق هيستون ، مثل كيف يساهم إزالة ميثيل بقايا هيستون ليسين في الإصابة بأمراض مختلفة. في حين تم تطبيق مقايسة المثيلة هذه لدراسة ديميثيلاز ، يمكن استخدامه أيضا لدراسة ترانسفيراز الميثيل أيضا.