Name: تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: تعلم قياس نشاط ديميثيلاز الليسين باستخدام طيف الكتلة MALDI والميثلة المخفضة. تتيح هذه الطريقة تحديد التغيرات في مستويات ميثلة الليسين عبر التسمية النظائرية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر مرفق البروتيوميات UAMS الطيفي للحصول على الدعم الشامل. وقدم التمويل لهذا المشروع من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة P20RR015569، P20RR016460 وR01DA025755.

يتم تعديل هذا البروتوكول من بلير وآخرون. 6. 1. LSD1 نزع الميثيل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر، والجمع بين 125 نانوغرام LSD1 المؤتلف مع 0.25 ميكروغرام ثنائي الميثيل الببتيد H3 هيستون (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK، البيوتين) في المخزن demethylase (50 ملم تريس، الكلور الرقم الهيدروجيني 8.5، 50 ملي بوكل، 5 مم MgCl 2، 5٪ الجلسرين). بالإضافة إلى ذلك، إجراء مراقبة الببتيد وحده لا الانزيم. عنصر التحكم للباب 3 وليس بحاجة مثيلة الاختزالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع الببتيدات، إضافة 8 R2 بوروس ميكرولتر الخرز ميكرون 20 إلى كل عينة، وتستنهض الهمم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تعد حبات بوروس من خلال تعليق 1 حجم من الخرز مع 1 حجم من الميثانول، ومن ثم إضافة 10 مجلدا من حمض الفورميك 5٪ / TFA 0.2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالة 2 C 18 ZipTips بواسطة الشفط 20 ميكرولتر من TFA 0.1٪ في رأس ودفع مرة أخرى خارجا مع pipettor. فعل هذا مرتين مع تي 0.1٪اتحاد كرة القدم، أربع مرات مع الأسيتونيتريل 70٪ / TFA 0.1٪، وأربع مرات مرة أخرى مع TFA 0.1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينتين (مراقبة وردود الفعل demethylase) على ZipTips C 18 مكيفة بواسطة pipetting الطين حبة وراء الراتنج C 18 في ZipTips ودفع من خلال حجم مع pipettor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ZipTips مرتين مع 20 ميكرولتر من TFA 0.1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل في 40 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 70٪ / TFA 0.1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize كل eluant تماما مع مكثف SpeedVac. </li></ol> 2. الاختزالية مثلأيشن يتم تعديل هذا الجزء من البروتوكول من بلير وآخرون. وRayment وآخرون. 6،7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق على رد فعل demethylase في 100 ميكرولتر من 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في رد فعل demethylase، إضافة 8 ميكرولتر من 15 ملغ / مل ثنائي ميثيل أمين borane. يذوب Borane ثنائي ميثيل أمين في 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4، لإعطاء 15 ملغ / مل حل الأوراق المالية.وينبغي بذل هذا الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في رد فعل demethylase، يضيف 16 ميكرولتر من الفورمالديهايد 250 مم deuterated. يتم تحضير 250 ملم الفورمالديهايد deuterated بواسطة تمييع الأوراق المالية في H 2 0. وينبغي بذل هذا الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.2 و 2.3 و 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 ساعة ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينة demethylase، إضافة 12.5 ميكرولتر من تريس 1M، ودرجة الحموضة 7.4 إلى إخماد رد فعل مثيلة الاختزالية. </li></ol> 3. MALDI قياس الطيف الكتلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بوروس الخرز R2 ميكرون 20 إلى رد فعل demethylase، وجمع في ZipTips كما هو موضح في الخطوات 1،3-1،6. </li></ol> ملاحظة: اعادة تعليق التحكم في 100 ميكرولتر من 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4 وعلاج مثل عينة أخرى بدءا من الخطوة 3.1. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل الرقابة وعينات من رد فعل demethylase ZipTips على طبق من ذهب عينة MALDI باستخدام 2 ميكرولتر من 33٪ تشبعد 2،5-dihydroxybenzoic حامض. لإعداد 33٪ حمض 2،5-dihydroxybenzoic، جعل محلول مشبع من 2،5-dihydroxybenzoic حامض في الأسيتونيتريل 70٪ / TFA 0.1٪ ومن ثم تمييع إلى 33٪ في الأسيتونيتريل مشبعة 70٪ / TFA 0.1٪. السماح للعينات مزال حتى يجف وبلورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع أطياف الشامل باستخدام مطياف الكتلة PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF أو متاح عالية الدقة MALDI مطياف الكتلة 8،9،10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الأطياف واستخراج المناطق الذروة باستخدام PerkinElmerSciex TOFworks البرنامج أو البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة مطياف الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من المنتجات رد فعل من قبل MS 2 مع نظام الإعلام المتاحة الطيفي توفير قدرات الشامل جنبا إلى جنب الطيفي. </li></ol> 4. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل التعويض عن التداخل النظائر التي تم إنشاؤها باستخدام الفورمالدهيد الثقيلة (الشكل 1B)، وتحديد منطقة ذروة (أ) نسبة 13 C 2 و 13 C اقاربهم النظائر 4ه إلى ذروة monoisotopic لعينة السيطرة، والتي لم يمر مثيلة مختزلة (الشكل 2A). مكافئ 1: 13C2 / A 12C = R 1 مكافئ 2: 13C4 / A 12C = ص 2 هذا وسوف أعطيك نسبة الببتيد الموجودة في هذه الدول النظائر (ص 1 و ص 2) محددة لتجربتك ومطياف الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام R 1 و R 2 القيم في الصيغ التالية لقياس القيمة النسبية من الببتيد الموجودة في كل ولاية تعديل في العينة رد فعل demethylase (الشكل 2B): مكافئ 3: H3K4me2 = A 1 مكافئ (4): H3K4me = A 2 - ص 1 (A 1) مكافئ 5: H3K4 = A 3 - ص 2 (A 1) - [ص 1 (A 2 - ص 1 (A 1))] </li></ol> 5. ممثل النتائج باستخدام LSD1، وتبين لنا مدى فعالية MassSQUIRM لقياسيسين نزع الميثيل. أجرينا كما هو موضح في القسم نص البروتوكول، وفحص demethylase مع 125 نانوغرام من LSD1 و 0.25 ميكروغرام ثنائي الميثيل هيستون H3 الببتيد (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK، البيوتين). وتعرض لسيطرة وعينات رد فعل demethylase إلى مثيلة الاختزالية وMALDI قياس الطيف الكتلي. وأظهرت ردود الفعل الرقابة التي لم يخضع مثيلة الاختزالية المغلف نموذجي النظائر لهذا الببتيد، وقدمت المناطق الذروة لمعادلات 1 و 2 (الشكل 2A). قدمت الطيف الكتلي للتفاعل demethylase مناطق الذروة لمعادلات 3-5 (الشكل 2B). باستخدام مناطق الذروة من الرقابة ورد فعل demethylase، توصلنا إلى أن LSD1 demethylated الببتيد لإعطاء رد فعل المنتجات التالية: 33.7٪ ثنائي الميثيل Lys4، 42.3٪ أحادية الميثيل Lys4، و 24٪ من الامم المتحدة وميثليته اليس 4. الرجوع إلى بلير وآخرون. لتحليل كامل للنشاط LSD1 demethylase فضلا عن دراسات المانع 6. لاحظ أن تغيير المتغيرات مثل انزيم، وقت رد الفعلوسوف تركز والركيزة تركيز إتاحة الفرصة لإجراء تحليل متعمق للنشاط. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> الشكل 1. MassSQUIRM نظرة عامة. (A) وأظهر الببتيد N-محطة من H3 هيستون بأنها الامم المتحدة (الأخضر)، أحادية (الحمراء)، أو ثنائي (الأزرق) في ليسين ميثليته 4. الاختلاف في التركيب الكيميائي للكل الببتيد يؤدي إلى التأين الفرق جعل مجمع الكمي. (ب) مثيلة انتقاصية تحويل جميع مخلفات يسين للدولة ثنائي الميثيل والذي يسبب كل الببتيدات لتأيين بالمثل. استخدام الفورمالدهايد الثقيلة في رد فعل مثيلة الاختزالية يسمح الإبقاء على هوية مثيلة الأصلي. الدوائر المفتوحة تشير مثيلة ضوء في حين تشير الدوائر المغلقة مثيلة الثقيلة. التعديل من بلير وآخرون 6 2011. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> الارقام ..ويمكن استخدام ه 2. MassSQUIRM لتحديد الببتيد ميثليته تفاضلي. (أ) تم تحليل وثنائي ميثليته الاصطناعية هيستون H3 الببتيد (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK، البيوتين) باستخدام الطيف الكتلي ونسب الذروة بالنسبة إلى الذروة monoisotopic وكما لوحظ ص 1 و ص 2 في المعادلات 1 و 2. (ب) وحضنت والببتيد نفسه الاصطناعية مع LSD1 نانوغرام 125 في demethylase العازلة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. وتعرض بعد ذلك عينات لتحليل MassSQUIRM. يسكنها خليط من تداخل القمم يمثل ثلاث ولايات مختلفة مثيلة كما رأينا في الشكل 1B. ولوحظت المناطق الخاضعة لقمم monoisotopic كما A 1، 2، و 3. واستخدمت المناطق الذروة في المعادلات 3-5. الدوائر المفتوحة تشير مثيلة ضوء في حين تشير الدوائر المغلقة مثيلة الثقيلة. التعديل من بلير وآخرون. 2011 6.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

ليس لدينا ما يكشف.

MassSQUIRM هي طريقة غير مكلفة والكمية لتحليل شامل لنشاط demethylases يسين المشاركين في أحادية و ثنائي مثيلة. MassSQUIRM تقدم الكميات ليس فقط من نتاج رد فعل، بل أيضا من أجل وسيطة. ويمكن استخدام هذا الاختبار باعتبارها أداة قوية في دراسة آلية demethylases هيستون LSD1 وغيرها. وسوف يكون من المفيد أيضا لتصنيف العديد من الإنزيمات المكتشفة حديثا demethylase يسين مثل PHF8 ويمكن استخدامها للانزيمات methyltransferase معينة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS العلوم البيولوجية </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-البيوتين الببتيد </td><td> أعدت في المنزل </td><td> لا شيء </td></tr><tr><td> بوروس R2 20 حبات ميكرون </td><td> النظم البيولوجية التطبيقية </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> ميليبور </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic حامض (TFA) </td><td> الحرارية </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> الأسيتونيتريل </td><td> الصياد </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2،5-dihydroxybenzoic حامض </td><td> سيغما </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borane ثنائي ميثيل أمين </td><td> سيغما </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> الثقيلة isotopically د 2-الفورمالديهايد </td><td> كامبردج النظائر مختبرات </tد&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> تريس </td><td> الصياد </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> الصياد </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> الصياد </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> الصياد </td><td> G33 </td></tr><tr><td> حمض الفورميك </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> الميثانول </td><td> الصياد </td><td> A452 </td></tr><tr><td> NA-فوسفات </td><td> الصياد </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac المكثف </td><td> رجل علم </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF مطياف الكتلة والبرمجيات TOFworks </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> لا شيء </td></tr></tbody></table>

تطبيق masssquirm لقياسات كمية من نشاط demethylase ليسين

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

مؤخرا، تم اكتشاف المنظمين جينية واللاعبين الرئيسيين في العديد من الأمراض المختلفة 1-3. ونتيجة لذلك، هذه الانزيمات من الاهداف الرئيسية لدراسات جزيء صغير والمخدرات 4 التنمية. المنظمين جينية كثيرة في الآونة الأخيرة فقط تم اكتشاف و لا تزال في طور تصنيفها. من بين هذه الانزيمات هي demethylases ليسين التي إزالة مجموعات الميثيل من lysines على histones والبروتينات الأخرى. نظرا لطبيعة رواية من هذا النوع من الانزيمات، وقد وضعت بعض المقايسات لدراسة نشاطها. وكان هذا كتلة الطريق إلى تصنيف كل من وعالية الإنتاجية من الدراسة demethylases هيستون. حاليا، المقايسات demethylase عدد قليل جدا من الوجود. تلك التي لا توجد تميل الى ان تكون ذات طابع نوعي، ولا يمكن تبين في وقت واحد بين الولايات مثيلة ليسين مختلفة (الامم المتحدة، أحادي، ثنائي وثلاثي). ويشيع استخدام الطيف الكتلي لتحديد نشاط demethylase ولكن هل الحالي المقايسات الطيفي الشامللا تتناول ما إذا الببتيدات ميثليته تفاضلي تأين بشكل مختلف. التأين الفرق من الببتيدات ميثليته يجعل من الصعب المقارنة بين الولايات مثيلة وبالتأكيد ليس كمي (الشكل 1A). وبالتالي ليست الأمثل المقايسات المتاحة لتحليل شامل للنشاط demethylase. نحن هنا وصف طريقة تسمى MassSQUIRM (تحديد الكميات الطيفي الشامل باستخدام مثيلة الاختزالية النظائر) والتي تقوم على مثيلة الاختزالية للجماعات أمين مع الفورمالدهيد deuterated لاجبار جميع lysines ليكون ثنائي ميثليته، مما يجعلها أساسا الأنواع الكيميائية نفسها، وبالتالي تأيين نفس (الشكل 1B). الفرق الكيميائية فقط بعد مثيلة الاختزالية هو الهيدروجين والديوتيريوم، الذي لا يؤثر على الكفاءة التأين MALDI. الفحص MassSQUIRM غير محددة لمنتجات التفاعل مع demethylase lysines الامم المتحدة، أحادية أو ثنائي ميثليته. الفحص ينطبق أيضا على methyltransferases يسين إعطاء SAلي منتجات التفاعل. هنا، ونحن نستخدم مزيج من الكيمياء مثيلة الاختزالية وMALDI مطياف الكتلة لقياس نشاط LSD1، وهو demethylase يسين قادر على إزالة ثنائي وأحادي الميثيل الجماعات، على ركيزة الببتيد الاصطناعية 5. هذا الفحص بسيط وقابلة بسهولة إلى أي مختبر مع الوصول إلى مطياف الكتلة MALDI في المختبر أو من خلال مرفق البروتيوميات. الفحص له ~ 8 أضعاف نطاق الدينامية وغير قابلة للتطوير بسهولة على شكل لوحة 5.

نحن نقدم طريقة لاستخدام MALDI قياس الطيف الكتلي والاختزالية الكيمياء مثيلة لقياس التغيرات في مثيلة ليسين.

تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين

اُكتشف مؤخراً أن المنظمات فوق الجينية تلعب دوراً رئيسياً في العديد من الأمراض المختلفة 1-3. ونتيجة لذلك، تُعد هذه الإنزيمات أهدافاً أساسية للجزيئات الصغيرة...

يهدف بروتوكول mass squirm إلى قياس نشاط إنزيم lysine demethylase باستخدام الميثيلة النظيرية ومطيافية الكتلة maldi؛ أولاً، يتم إجراء تفاعلات إزالة الميثيل المحفزة إنزيمياً على ببتيدات تحتوي على بقايا lysine مُميثلة. بعد ذلك، يتم إجراء ميثيلة كيميائية لنواتج الببتيد الناتجة عن تفاعل demethylase باستخدام formaldehyde مُدُتَر، لإنتاج ببتيدات مُميثلة بشكل موحد تتأين بالطريقة نفسها عبر maldi. ثم يتم الانتقال إلى قياس كمية كل نوع من الببتيدات باستخدام مطيافية الكتلة maldi مع مراعاة التداخل النظيري. ومن أجل تحديد الكميات النسبية للببتيدات غير المُميثلة والمُميثلة أحادياً وثنائياً وثلاثياً، تحدد نتائج mass squirm الكميات النسبية لكل ناتج من تفاعل demethylase بناءً على التغيرات في الكتلة.تتمثل الميزة الأساسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل قياس الطيف الكتلي الروتيني، في أن درجة الكتلة تأخذ في الاعتبار الاختلافات في التأين بين الببتيدات الميثيلية المختلفة. وقد خطرت لنا فكرة هذا النهج لأول مرة عندما طورنا طريقة لقياس مستويات أستلة الهيستون باستخدام أنهيدريد الأسيتيك الثقيل نظائرياً. ويكمن التحدي في هذه التقنية في استخراج بيانات مساحة القمة، والتي قد تصبح معقدة بسبب تداخل الأغلفة النظائرية للببتيدات.لإجراء تفاعل إزالة الميثيل، اخلط 125 nanograms من إنزيم lysine specific demethylase one المؤتلف مع 0.25 micrograms من ببتيد dimethyl hisone H three المبيوتني في حجم نهائي قدره 20 microliters من محلول demethylase buffer. قم أيضاً بتحضير عينة ضابطة تحتوي على 0.25 micrograms من الببتيد بدون إنزيم LSD one. يتم تحضين أنابيب التفاعل والعينة الضابطة لمدة ساعتين عند 37 degrees Celsius. بعد ذلك، ولتحضير حبيبات R two ذات المسام بحجم 20 micron، اخلط أحجاماً متساوية من الحبيبات والميثانول.ثم أضف 10 أحجام من حمض TFA حمض الفورميك، وأضف ثمانية ميكرولتر من الخرز المسامي إلى كل عينة ورجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي هذه الأثناء، قم بتهيئة اثنين من رؤوس C 18 zip tips. وذلك عن طريق السحب والضخ مرتين باستخدام 20 ميكرولتر من 0.1%TFA، وأربع مرات باستخدام 70%aceto nitrile 0.1%TFA، وأربع مرات أخرى باستخدام 0.1%TFA.بعد ذلك، يتم تحميل العينتين على رؤوس Zip tips المهيأة. وباستخدام الماصة، يتم دفع الحجم عبر راتنج C 18. تُكرر هذه العملية حتى يتم دفع الحجم الكلي لكلتا العينتين عبر رؤوس Zip tips.بعد ذلك، تُغسل رؤوس Zip tips مرتين باستخدام 20 µL من 0.1%TFA، ثم تُستخلص العينات في 40 µL من محلول الـ elution buffer، ثم تُجفف تماماً باستخدام جهاز SpeedVac concentrator. أولاً، يُعاد تعليق العينة في 100 µL من محلول phosphate buffer بتركيز 50 mM وpH 7.4. ثم يُضاف 8 µL من bore dimethyl amine و 16 µL من derated formaldehyde.يُحضن الخليط عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين. تُكرر عملية الميثيلة الاختزالية بإضافة boring dimethyl lamine وdeuterated formaldehyde ثم يُحضن الخليط لمدة ساعتين. وفي المرة الثالثة، يُضاف boring dimethyl lamine ويُحضن الخليط عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 ساعة.أوقف التفاعل بإضافة 12.5 µL من محلول tris بتركيز 1 M ورقم هيدروجيني pH 7.4، ثم ابدأ بتجفيف العينات تماماً باستخدام جهاز تركيز SpeedVac. بعد ذلك، أعد تعليق عينات التحكم وعينات تفاعل نزع الميثيل في 100 µL من محلول منظم الفوسفات بتركيز 50 mM ورقم هيدروجيني pH 7.4.أضف الآن 8 µL من الخرز المسامي إلى عينات التحكم وعينات تفاعل demethylase، ثم اجمعها باستخدام رؤوس zip tips كما هو موضح سابقاً. قم بإخراج المواد في أحجام قدرها 2 µL على لوحة عينات MALDI واتركها لتجف في درجة حرارة الغرفة حتى تتبلور. انتقل بعد ذلك إلى تحليل العينات باستخدام مطياف الكتلة.افتح ملفات الطيف في برنامج العمل وقم بتصديرها إلى برنامج M over Z. ثم تحقق من نواتج التفاعل باستخدام مطيافية الكتلة الترادفية. أولاً، حدد نسبة مساحة القمة لنظائر الكربون 13 C two والكربون 13 C four بالنسبة لقمة النظير الأحادي لعينة الضبط.استخدم هذه النسب المحسوبة لتحديد الكمية النسبية للببتيد الموجودة في كل تعديل. حالة عينة تفاعل إنزيم نزع الميثيل. يمكن استخدام إنزيم LSD الواحد بفعالية في تقدير كمية نزع ميثيل الليسين عبر مطياف الكتلة.بما أن تفاعل الضبط لا يخضع للمثيلة الاختزالية، فإنه يشير إلى الغلاف النظائري النموذجي لهذا الببتيد. وتحدد مساحات القمم الناتجة نسب الخلفية للببتيد الموجود في carbon 13 C two و carbon 13 C four. وتسمح الحالات النظائرية ومساحات القمم من طيف الكتلة لتفاعل الضبط بتحديد الكمية النسبية للببتيد الموجود في كل حالة تعديل. وفي تفاعل نزع المثيلة، تحدد مساحات القمم من تفاعلات الضبط ونزع المثيلة هذه أن 33.7% dimethyl lysine 4 42 و 0.3% monomethyl lysine four و 24% unmethylated lysine four.يوفر نهج قياس الكتلة هذا رؤى أساسية في مجال علم فوق الجينات للهستونات، مثل كيفية مساهمة إزالة الميثيل من بقايا ليسين الهستون في أمراض مختلفة. وبينما تم تطبيق مقايسة الميثيلة هذه لدراسة إنزيمات إزالة الميثيل، يمكن استخدامها أيضاً لدراسة إنزيمات نقل الميثيل.

application-masssquirm-for-quantitative-measurements-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويتم رصد نشاط كربوكسيل محرض يسين عن طريق تفاعل الركيزة L - يسين وكادافيرين المنتج مع 2،4،6 trinitrobenzensulfonic الحمضية لتشكيل adducts التي الذوبان في الفرق التولوين.

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

&lt; p class = "jove_content" &gt; يتم وصف طريقتين لتعيين إشارات الرنين المغناطيسي النووي α و ε-dimethylamine ليسين N-terminal N 13ميثيلا مختزلا. تستخدم إحدى الطرق الانتقائية الناجمة عن الأس الهيدروجيني لتفاعل المثيلة الاختزالي ، والأخرى تستخدم أمينوببتيداز لإزالة اللايسين الطرفي N بشكل انتقائي.

طرق تحديد رنين الرنين المغناطيسي النووي ل 13C-dimethyl N-terminal amine على البروتينات الميثيلية المختزلة

من خلال الجمع بين الأم ويشابك مناعي لونين مع عالية الدقة الطيف الكتلي، نهج ChroP تمكن من تشريح بنية البروتين المركب من التعديلات هيستون، المتغيرات والبروتينات غير histonic التآزر في المجالات ونين متميزة وظيفيا.

النهج ChroP يجمع بين الشذرة والطيف الكتلي لتشريح المناظر الطبيعية البروتيومية الحالة رقم محدد من الكروماتين

يمكن استخدام  مصفوفات الببتيد المركبة بطريقة SPOT لتحليل خصوصية الركيزة لبروتين ليسين ميثيل ترانسفيراز (PKMTs) ولتحديد طيف الركيزة ل PKMTs لفهم دورها البيولوجي. يصف هذا البروتوكول كيفية تصنيع مصفوفات الببتيد ، وميثيليتها باستخدام PKMTs ، وتحليل النتائج.

تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يتم تقديم بروتوكول لتصنيع الببتويدات ذات الوظائف الكاتيونية المختلطة في نفس التسلسل (مونومرات من نوع اللايسين والأرجينين). كما تم وصف الاختبارات اللاحقة لهذه المركبات ضد الليشمانيا المكسيكية ، وهي طفيليات أوليات تسبب داء الليشمانيات الجلدي.

وسيلة فعالة لتخليق Peptoids مع مونمرات مختلط ليسين من نوع / ارجينين من نوع وتقييم نشاطهم مكافحة يشماني

هنا، فإننا نقدم القياس الكمي غير منحازة للبروتين خاصة بالموقع شغل أسيتيليشن و/أو سوكسينيليشن (ستويتشيوميتري) للبروتين الكامل عن طريق تحليل راتيوميتريك الذاتية تعديلات على التعديلات التي أدخلت بعد الكمية أسيليشن الكيميائية استخدام مستقرة أو أملاحه المسماة النظائر. في تركيبة مع حيازة مستقلة عن البيانات الحساسة الكتلي، يتم الحصول على قياسات شغل الموقع دقيقة.

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

هنا، نقدم بروتوكوللقياس المشاركة المستهدفة KDM1A في خلية بشرية أو حيوانية، أو أنسجة أو عينات دم عولجت بمثبطات KDM1A. يستخدم البروتوكول وضع علامات المسبار الكيميائي لإنزيم KDM1A المجاني والتحديد الكمي المباشر للمهنة المستهدفة باستخدام الاختبارات المناعية المستندة إلى العلاج الكيميائي ويمكن استخدامها في الدراسات ما قبل السريرية والسريرية.

القياس المباشر للمشاركة المستهدفة KDM1A باستخدام الاختبارات المناعية المستندة إلى العلاج الكيميائي

بروتين أرجينين (R) - مثيلة هو تعديل واسع الانتشار بعد الترجمة ينظم مسارات بيولوجية متعددة. يعد قياس الطيف الكتلي أفضل تقنية لتحديد ملامح R-methyl-proteome عالميا ، عندما يقترن بالنهج الكيميائية الحيوية لتخصيب الببتيد المعدل. يتم وصف سير العمل المصمم لتحديد الثقة العالية لمثيلة R العالمية في الخلايا البشرية هنا.

نهج البروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي لتحليل مثيلة البروتين R العالمية وعالية الثقة

توفر هذه البروتوكولات المنهجية المستخدمة لتقييم النشاط الأنزيمي لأفراد عائلة البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMT) في الخلايا. يتم وصف إرشادات مفصلة حول تقييم نشاط PRMT باستخدام المؤشرات الحيوية الذاتية والخارجية ، والتعرف على الميثيل أرجينين الأجسام المضادة ، ومركبات أداة المانع.

الأساليب الكمية لدراسة البروتين أرجينين ميثيلترانسفيراز 1-9 النشاط في الخلايا

أسست هذه الدراسة طريقة تستخدم توسع الشيفرة الجينية لدمج اللاكتيل-ليسين (Klac) بنجاح في مواقع محددة من الإنولاز-1 البشري (hENO1) والسوبرفولد GFP (sfGFP) في الخلايا الإشريكية القولونية والثدييات.

لاكتلة الليسين الخاصة بالموقع عبر توسع الشيفرة الجينية في الإشريكية القولونية وخلايا الثدييات

تعلم قياس نشاط ديميثيلاز الليسين باستخدام طيف الكتلة MALDI والميثلة المخفضة. تتيح هذه الطريقة تحديد التغيرات في مستويات ميثلة الليسين عبر التسمية النظائرية بدقة عالية.

تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين

استكشف المزيد من الفيديوهات