Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

في هذا الإجراء ، نعرض نهج الفحص المجهري الكمي داخل الحيوية لتقييم ديناميكيات مرور الطفيليات عبر الطحال. في نموذج الملاريا للقوارض ، يتم تحضير الفئران المصابة بالطفيليات المعدلة وراثيا GFP للفحص المجهري داخل الحيوية لقنية الوريد الطحال سيسمح بحقن الأصباغ داخل الحيوية. أثناء التجربة ، تتحرك الخلايا الفلورية في مناطق مختلفة من الطحال.

نحن نقدم الأساطير لوصف حركة الطفيليات في الحجرة البطيئة ثلاثية الأبعاد من اللب الأحمر وحساب تدفق دم الأوعية الدموية. تم استخدام هذه المعلمات لمقارنة ديناميكيات الطحال لسلالتين من PULE. مرحبًا بالجميع.

اسمي ناندو إل بورتيلو وأحد أسئلة البحث الرئيسية في مختبري هو محاولة فهم دور الطحال في الملاريا. يعد تضخم الطحال S أحد معالم هذا المرض ، ولكن بسبب المشكلات الفنية والأخلاقية ، فإن محاولة معالجة دراسات هذا العضو أمر صعب للغاية. من أجل القيام بذلك ، قمنا بتمكين التقنيات التي تسمح لنا برؤية المرور الديناميكي لهذا الطفيلي وتحديد هذه الظاهرة.

هذا ما سيشرحه لورينا ومي في هذه البروتوكولات. يتم إجراء هذا البحث جزئيا بالتعاون مع مجموعات الدكتور لر من جامعة هامبورغ في ألمانيا والدكتورة ماريا كبو هنا في عيادة المستشفى وتلقى التمويل العام من فيون سيلكس الموجود ووكالة المخابرات المركزية الوزارية في العدوى الإسبانية تبدأ من المتبرع M المصاب إما بطفيليات GFP القاتلة أو غير المميتة بنسبة 10٪ طفيليات. للتحقق من الطفيلي ، خذ قطرة دم صغيرة من وريد ذيل الفأر وقم بتمديدها على المجهر.

حرك تلطيخ متري الثقل باستخدام GIMs. سيسمح المحلول بتصور خلايا الدم الحمراء المصابة بمجرد تجفيفها ، وإصلاح مسحة الدم بالميثانول لمدة دقيقتين ، وتطبيق محلول GIMs واحتضانه لمدة 20 دقيقة. اغسل الشريحة بماء الصنبور الحالي وجفف النسبة المئوية لثنائي الفينيل الثنائي الفينيل على إجمالي كرات الدم الحمراء باستخدام مجهر ضوئي مع مائة x زيت. هدف.

إصابة الفئران بالطفيليات القاتلة أو غير المميتة التي تم الحصول عليها من دم ذيل الفئران المتبرعة المخففة في PBS. ضبط الجرعة لحقن نصف مليون طفيلي لكل فأر من أجل الوصول إلى طفيلي محيطي بنسبة 1٪ في اليوم الثالث بعد الإصابة وحقن داخل الصفاق. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام كرات الدم الحمراء المسماة FITC في التحكم.

ملليلترا واحدا من الدم الشرياني من الفأر وتغسل الحبيبات عن طريق الطرد المركزي في PBS التي تحتوي على EDTA في محلول FITC وتحتضن لمدة ساعتين في الظلام مع تحريض لطيف. بعد ذلك الوقت ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي واغسلها على نطاق واسع. حقن في فأرة التحكم بمتوسط 1٪ في الدورة الدموية المحيطية والمضي قدما في التجارب في الجسم الحي.

مرحبا ، أنا ميجا. لتصوير الطحال في الجسم الحي ، نحتاج إلى إجراء تآزر صغير للحيوان لفضح الطحال على هذه التقنية بشكل واضح. لقد تعلمت ذلك من ستيفاني GR في مختبر العامل Heisler ، الذي أود أن أشكره والآن سأوضح لك كيفية المضي قدما.

تصوير العضلية المصابة يتم إجراؤه في اليوم الثالث بعد الإصابة عندما يكون البارات 1٪ في كلتا السلالتين. حافظ على مخدر الفأر وفي درجة حرارة منظمة طوال العملية. احم العينين من الترطيب وتحقق من تخدير الفأر تماما عن طريق اختبار اتصال وسادة القدم قبل المتابعة لتسهيل إعطاء المواد عن طريق الوريد.

أثناء التجربة ، قم بتقطيع وريد ذيل الفأر لبناء القنية. أدخل إبرة صغيرة في أحد طرفي الأنبوب وقضيبها في الطرف الآخر. قم بتحميل القنية بفقاعات إزالة المحلول الملحي الفسيولوجي ، وتأكد من أن المحلول يتدفق بشكل صحيح عبر القنية.

تقشير الوريد الجانبي للذيل نظيفا. تعزيز رؤيتها عن طريق القيام بانقباض ناعم في قاعدة الذيل. أدخل طرف القنية داخل الوريد.

سيشير ظهور الدم إلى أن الإبرة في وضع جيد. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر القنية في المنبع من الوريد ، ثم قم بإصلاح القنية على الذيل باستخدام الغراء والشريط. كشف الجزء السفلي من الطحال من خلال شق صغير في الجلد والعضلات في الجانب الظهري الأيسر من.

ضع الطحال حيث لوحظت حركة تنفس أقل وقم بتطبيق PBS على السطح المكشوف لإبقائه نظيفا من شعر الفأر ورطوبته. ختم الطحال بغطاء للنوم للسماح بالتصور. مرحبا ، اسمي لورينا.

سيسمح لنا البروتوكول الموضح بتصور حركة طفيليات PULI عبر الطحال. كان هذا ممكنا بفضل الطفيليات المعدلة وراثيا GFP. يرجى التبرع من قبل جيمس بيرنز من جامعة دريكسل.

ستتيح لنا حركة تصوير الطفيليات الفلورية معرفة ما إذا كان هناك اختلاف في السلوك بين السلالات المميتة وغير المميتة. تم إجراء تجارب الفحص المجهري فيدال في مجهر لايكا متعدد الفوتون ، ومجهز بنظام حضانة مع التحكم في درجة الحرارة وهدف 63 × الجلسرين. ضع على مسرح المجهر مع غطاء طحال النوم متجها لأسفل إلى الهدف. البدايه.

سيوفر تصور الطحال عند التكبير المنخفض رؤية عامة لبنية الدورة الدموية الدقيقة للعضو. تركيز الطحال باستخدام الأنسجة الفلورية الذاتية لوحظت طفيليات GFP تمر عبر مناطق مختلفة من الطحال. مرحبا ، اسمي ماريا ألبو من المراكز العلمية والتكنولوجية من جامعة برشلونة ، وسنقوم بالتصوير داخل الطحال.

من أجل دراسة تدفق الدم وحركة خلايا الدم الحمراء المصابة ، سنستخدم مجهر متحد البؤر مزودا بفحص رنين يسمح بالتصوير عالي السرعة المفيد جدا لتجنب حركة العضو. هذا مجهر طيفي يسمح بتحديد نطاق الرؤية. من أجل التصوير بسرعة كبيرة ، سنقوم بالحصول على اثنين من الفلورسين ، والعلامات والانعكاس.

حدد مناطق مختلفة للتصوير بمساعدة كرات الدم الحمراء ، والانعكاس ، والتباين ، وأصباغ فيدال لإثبات الأوعية الدموية الدقيقة في الطحال. سنشرح الآن كيفية قياس حركة الطفيليات في تدفق دم الأوعية الدموية باستخدام الفحص المجهري فيدال وبرنامج الصورة J لمتابعة حركة الطفيليات في الشبكة ثلاثية الأبعاد لللب الأحمر. احصل على صور من خلال خمسة أعماق Z باستخدام وضع المسح الضوئي عالي السرعة.

قم بتحويل مكدسات الصور إلى أفلام ملونة مشفرة بحرف Z لتسهيل تتبع خلايا فلورسنت واحدة. يتم توفير معلومات تفصيلية في النص ، وتتبع الجسيمات المختلفة بمرور الوقت على العمق في كل مقطع فيديو باستخدام إحداثيات X و Y و Z و T ، ويمكن حساب معلمات التنقل مثل الاتجاه ومتوسط السرعة ووقت الإقامة وتمثيلها كخرائط توزيع لتمكين التحليل المقارن بين مجموعات السلالة. يمكن تصوير تدفق الأوعية الدموية في الطحال عن طريق الحقن الجهازي للعديد من جزيئات الفلورسنت الموضحة في الجدول الداعم مثل الدكسترين.

وباستخدام تباين انعكاس كريات الدم الحمراء الذاتية ، قم بمسح تدفق الدم في الخط المركزي عن طريق ضبط الأوعية أفقيا في اتجاه المسح بالليزر واستخدام متوسط الخط المحسن. في هذه الصور ، سيتم استخدام الخطوط الناتجة عن الخلايا المتحركة لحساب تدفق الدم ، والتقاط صور للأوعية بأقطار مختلفة وخلال الدورة القلبية للتعويض عن التقلبات. لطالما اعتبر الطحال صندوقا أسود في أبحاث الملاريا ، وهنا قمنا بتطوير نهج الفحص المجهري الكمي داخل الحيوية لاكتساب نظرة ثاقبة لديناميكيات عدوى الطفيليات وتدفق الدم في هذا العضو ، مما يسمح لنا بمعالجة الأسئلة البيولوجية المهمة مثل الالتصاق في الجسم الحي لخلايا الدم الحمراء المصابة بالطحال.

شكرا لك و.