بناء هيدروجيل الكولاجين لتسليم الشيتوزان الجذعية المجهرية الخلية محملة

يقدم هذا البروتوكول استراتيجية في المختبر لتوصيل الخلايا الجذعية من كريات الشيتوزان المجهرية إلى سقالة هلام الكولاجين والحصاد والثقافة. ثم تقوم الخلايا الجذعية الشحمية الأولية باستحلاب واستعادة مستحضر الكريات المجهرية للشيتوزان. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا الجذعية على كريات شيتوزان المجهرية وزرعها في إدراج لوحة ثقافة غشائية بحجم ثمانية ميكرون لإنتاج CSM محمل ب CS ، وأخيرا قم بخلط نظام توصيل الكرة المجهرية مع سقالة هلام الكولاجين ثلاثية الأبعاد.

في النهاية ، يوفر نظام CSM هذا إمكانية الاستخدام في الطب التجديدي وتوصيل الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل حقن الخلايا أو التغليف الدقيق ، هي قدرة الخلايا على الالتصاق بمادة حاملة والاستمرار بعد التطبيق الأولي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الكريات المجهرية esan لها شحنة ثابتة متأصلة.

وسيكون تحميل الخلايا فوق سرير مجهري أمرا صعبا دون إزعاجها. استئصال وغسل ، الأنسجة الدهنية العجانية والبشرة من التفاف افرم الأنسجة ، ثم نقل غرام إلى جرامين إلى 25 ملليلتر من HBSS تحتوي على 1٪ FBS. بعد الطرد المركزي ، اجمع طبقة الأنسجة الدهنية العائمة الحرة في قارورة إرلينماير سعة 125 مل.

أضف 25 مل من الكولاجيناز من النوع الثاني واحتضن التفاعل على شاكر مداري. الآن قم بإزالة الجزء السائل بعناية أسفل طبقة الزيت والدهون وقم بالتصفية بالتتابع من خلال مرشحات شبكة النايلون بحجم 170 ميكرون. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بعد غسلتين ب 25 ملليلترا.

HBSS Resus, تعليق الحبيبات في 30 ملليلتر من وسط نمو mesen pro المكملة. قم بتقسيم الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون المنقاة إلى قارورتين من ثقافة T 75 وتضخيم مستحضر A SC في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. بروتوكول CSM هذا عبارة عن عملية استحلاب في الماء في الزيت تستخدم تقنية الحفر الأيونية.

استحلب ستة ملليلتر من محلول مائي من الشيتوزان في 100 مل من خليط طور الزيت باستخدام التحريك العلوي والمغناطيسي في وقت واحد في اتجاهين متعاكسين لمدة ساعة واحدة إلى مستحلب الماء والزيت المستقر ، أضف 1.5 مل من هيدروكسيد البوتاسيوم 1٪ في n ثماني كل 15 دقيقة لمدة أربع ساعات. بعد الانتهاء من تفاعل الربط المتقاطع الأيوني ، قم بصب مرحلة الزيت ببطء وأضف الكرات على الفور إلى 100 مل من الأسيتون. اغسل الكرات بالأسيتون حتى تتم إزالة مرحلة الزيت تماما.

ثم جفف الكرات المستردة في فراغ. يحدد المجفف متوسط مساحة سطح حجم جسيمات CSM لكل ملليغرام ووحدة الحجم المكعب باستخدام محلل حجم الجسيمات. استمر في غسل CSM ثلاث مرات بالماء المعقم لإزالة الأملاح المتبقية.

الآن قم بتعقيم مستحضر CSM بالكحول المطلق لاستخدامه في تجارب الخلايا في أنبوب زجاجي سعة 50 مليلتر ، واخلط خمسة ملليغرامات من الكريات المجهرية مع مليلتر واحد من محلول TNBS 0.5٪ يحتضن لمدة أربع ساعات عند 40 درجة مئوية. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من ستة حمض الهيدروكلوريك العادي واحتضانه عند 60 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد تبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف خمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات و 10 مل من إيثيل إيثر.

لاستخراج TNBS الحرة ، قم بإزالة كمية خمسة ملليلتر من الطور المائي وقم بتسخينها إلى 40 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة لتبخر أي إيثر متبقي بعد التبريد إلى درجة الحرارة المحيطة. خفف ب 15 مل من الماء باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس امتصاص كريات الكيتوزان المجهرية المحضرة عند 345 نانومتر باستخدام TNBS كفارغة.

قم أيضا بقياس الشيتوزان المستخدم في تحضير CSM. الآن ، احسب عدد المجموعات الأمينية الحرة ل CSM بالنسبة إلى العدد الإجمالي للمجموعات الأمينية في الشيتوزان. موازنة خمسة ملليغرام من CSM المعقم في HBSS المعقم بين عشية وضحاها.

انقل CSM إلى إدراج غشاء ثمانية ميكرون ل 24 لوحة ثقافة بئر. بعد أن تستقر CSM ، استنشق HBSS بعناية. أضف الآن 300 ميكرولتر من وسط النمو إلى داخل الملحق ، و 700 ميكرولتر من وسائط النمو إلى الخارج من الإدراج. ريسوس.

قم بتعليق الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون في 200 ميكرولتر من النمو ، والوسط والبذور فوق CSM داخل لوحة الاستزراع. أدخل الحاضنة لمدة 24 ساعة في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. انقل CSM المحمل SC إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم دون إزعاج الخلايا التي هاجرت إلى غشاء الإدخال.

الآن قم بإزالة الوسط المتبقي وأضف 250 ميكرولترا من وسط النمو الطازج إلى كل أنبوب. أضف 25 ميكرولتر من خمسة ملليغرام لكل مليلتر من محلول MTT واحتضنه لمدة أربع ساعات. قم بإزالة الوسائط وأضف 250 ميكرولتر من دوامة أكسيد ثنائي ميثيل كبريت لإذابة جهاز الطرد المركزي المركب ASAN ، CSM عند 2 ، 700 جم لمدة خمس دقائق.

قم بقياس امتصاص المادة الطافية عند 570 نانومتر باستخدام 630 نانومتر كمرجع. تابع لتحديد رقم الخلية المرتبط ب CSM بالنسبة لقيمة الامتصاص التي تم الحصول عليها من الأعداد المعروفة من A SC القابلة للحياة. امزج خمسة ملليغرامات من CSM المحمل SC مع 7.5 ملليغرام لكل ملليلتر. النوع الأول من الكولاجين المستخرج من الفئران.

وتر الذيل ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.8 باستخدام اثنين من هيدروكسيد الصوديوم العادي واسكبه في صفيحة الزاعفة. أدخل في الألياف الآن ، وانقله إلى طبق مكون من 12 بئرا واحتضانه لمدة 30 دقيقة. استمر في تحديث وسط المواد الهلامية COLLAGEN A-S-C-C-S-M كل يومين من فترة الحضانة.

قم أيضا بمراقبة الخلايا وإطلاقها وهجرتها من CSM إلى الجل باستخدام تقنيات الفحص المجهري القياسية. يصف هذا المثال التالي استراتيجية المختبر لتوصيل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون من كريات الشيتوزان المجهرية إلى سقالة هلام الكولاجين. تشير صور SEM و TEM إلى تحضير CSM مسامي بحجم موحد.

تشير حضانة الكريات المجهرية بالخلايا الجذعية المشتقة من الدهون الأولية إلى وجود 4 000 خلية لكل ملليغرام من الكالسيوم CSM. يظهر تلطيخ SC انتشارا فوق CSM مع تمديد الخيط في الشقوق المسامية للكرة المجهرية. عندما تم خلط CSM المحمل بالخلية مع هلام الكولاجين ، تهاجر الخلايا إلى الجل ويمكن اتباعها بمرور الوقت.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية على الفور نحو علاج فقدان الأنسجة الهائل والمزمن. ومع ذلك ، فإن نظام العلاج هذا لديه إمكانات أكبر بكثير نظرا لتعدد استخداماته للتكامل مع مجموعة متنوعة من الخلايا و / أو المواد الحيوية المستخدمة لعلاج مستويات مختلفة من فقدان الأنسجة الرخوة والقلبية. الشك في أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتسليم الخلية المضيفة.

يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل الحقن ، وتقديم الأدوية العلاجية ، وتطوير أنظمة هجينة لتقديم كل من الخلايا والأدوية العلاجية معا.