على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل تطور الشجرة التغصنية لخلية burkini تحت ظروف تجريبية مختلفة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إعداد مستنبتات شرائح عضوية للمخيخ في الفئران بعد الولادة. بعد ذلك، يتم استنبات شرائح المستنبتات تحت ظروف تجريبية متنوعة.

على سبيل المثال، يتم اختبار تأثير محفزات MGL R one، ثم تُثبت المزارع وتُكشف المورفولوجيا الخاصة بخلايا Purkinje الفردية والأشجار التغصنية عن طريق التلوين المناعي لـ Calbindin. وتتمثل الخطوة النهائية في تحليل الأشجار التغصنية لخلايا Purkinje التي نمت تحت ظروف ضابطة أو تجريبية، وذلك بالاعتماد في النهاية على المجهر الفلوري لخلايا Purkinje الملونة مناعيًا، حيث يُظهر التقييم الكمي لحجم وتفرع أشجارها التغصنية أن تنشيط مستقبل الناقل العصبي، وتحديدًا MGL R one، يؤثر بشكل عميق على تطور الشجرة التغصنية لخلايا Purkinje.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن النمو الكامل تقريباً لنهايات خلايا بيركين يحدث خلال فترة الزرع، وبالتالي يمكن دراسة مسألة معقدة للغاية مثل تطور الشجرة التغصنية في بيئة مخبرية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا العصبية التطورية، مثل كيفية تأثير النشاط على نمو وتطور الزوائد العصبونية. لبدء هذا الإجراء، يتم تشريح المخيخ من دماغ جرو فأر PA في وسط تحضير بارد جداً (بدرجة حرارة الجليد) باستخدام مجهر ستيريو.

بعد ذلك، يتم تقطيع المخيخ إلى شرائح بسمك 350 micron في الاتجاه السهمي باستخدام مفرمة أنسجة McIlwain. وبعد فصل الشرائح، توضع على إدخالات Millipore للزراعة الخلوية بمعدل ست شرائح تقريبًا لكل إدخال. ثم تُحضن في أطباق ذات ستة آبار مملوءة مسبقًا بـ 0.75 milliliters من وسط الحضن لكل بئر، وذلك في جو رطب يحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 degrees Celsius.

ابدأ العلاجات الدوائية في اليوم الثالث من الزراعة المخبرية (in vitro) عن طريق إضافة PMA أو DHPG بالتركيز المطلوب إلى وسط الزراعة. قم بتجديد الأدوية بالتزامن مع تغيير وسط الزراعة كل يومين أو ثلاثة أيام. من أجل تثبيت المزارع.

أولاً، قم بإزالة وسط الزرع، ثم أضف بعناية 3 mL من البارافورمالدهيد إلى كل بئر تحتوي على شرائح المخيخ المثبتة على غشاء Millicell-Insert. بعد تثبيت المزارع طوال الليل، قم بإزالة المثبت. بعد ذلك، اشطف المزارع باستخدام محلول الفوسفات المنظم.

بعد ذلك، أضف الجسم المضاد للأرنب المضاد لبروتين الكالبندين (rabbit anti calbindin)، المخفف في محلول الحجب، إلى المزرعة. خفف الجسم المضاد للأرنب المضاد للكالبندين بنسبة 1:1000 للتصوير الانتقائي لخلايا بيركينجي (perikaryon cells)، والجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لبروتين NeuN بنسبة 1:500 في محلول الحجب للتصوير الانتقائي للخلايا الحبيبية.

قم بتحضين المزارع معها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C تحت تقليب بطيء. وفي اليوم التالي، اشطف المزارع ثلاث مرات باستخدام منظم الفوسفات بتركيز 0.1 molar، ثم خفف الأجسام المضادة الثانوية: Goat anti rabbit, Alexa 5 68 وgoat anti mouse Alexa 4 88 بنسبة 1:500 في منظم الفوسفات بتركيز 0.1 molar، مضافاً إليه 0.1% Triton X 100.

قم بتحضين المزارع معها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. وبعد شطف المزارع ثلاث مرات في محلول الفوسفات المنظم، قم بإزالة شرائح الصبغة من بئر المزرعة باستخدام فرشاة رسم وثبتها على شرائح زجاجية من نوع super frosts plus. ضع أغطية الشرائح مع استخدام وسط تثبيت مناسب.

بعد ذلك، يتم فحص المستنبتات باستخدام مجهر عادي مجهز بجهاز فلورة فوقي (epi fluorescence) أو باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) مع وسم فلوري لخلايا bikini. ويمكن قياس حجم الشجرة الشجيرية لخلية معينة بسهولة إذا كانت الشجرة لا تتداخل مع خلايا أخرى. وبمجرد تحديد خلية bikini ذات شجرة شجيرية غير متداخلة، يتم فحصها باستخدام عدسة 20x.

يتم تسجيل الصورة باستخدام كاميرا رقمية ثم تُحلل باستخدام برنامج لتحليل الصور. يُستخدم في مختبرنا برنامج image Pro plus، والذي يتيح تحديد مخطط الشجرة التغصنية للخلية بنقرة واحدة بالفأرة.

باستخدام أداة العصا السحرية (magic wand) في وضع القياس، يقوم البرنامج بعد ذلك بحساب المساحة التي تغطيها الشجرة الشجيرية وتصديرها إلى برنامج Ms.Xl. ثم يتم إجراء التحليل الإحصائي للبيانات باستخدام برنامج GraphPad Prism لتحديد عدد نقاط التفرع. ونظراً للمورفولوجيا الدقيقة وشديدة التفرع لشجرة ENDR في خلايا kinji، يجب عدّها يدوياً. يتم تكبير ملف صورة خلايا kinji بمقدار 20x بحيث تغطي معظم الشاشة باستخدام برنامج Adobe Photoshop.

بعد ذلك، يتم عد كل نقطة تفرع وتمييزها بنقطة حمراء. وقد تم تصوير خلايا bikini المحددة بشكل متكرر لمراقبة نمو الشجرة التغصنية. ومن اليوم الثاني (div two) إلى اليوم السابع (div seven)، كان هناك نمو مستمر في تفرع الزوائد الشجرية.

من اليوم الرابع إلى اليوم الحادي عشر، تمددت الشجرة التغصنية بشكل ملحوظ. موضح. هنا تظهر أمثلة على تثبيط تطور الشجرة التغصنية للخلايا من نوع bikini بواسطة p KC أو mgl R one، التحفيز A وD يظهران الخلايا الضابطة غير المعالجة مع شجرة تغصنية مكتملة النمو. بعد تسعة أيام من المعالجة بـ PMA، تبدو التغصنات أكثر سمكاً، ويتقلص حجم الشجرة التغصنية بشكل كبير كما هو موضح في BNE.

من ناحية أخرى، أظهرت صور CNF أنه بعد تسعة أيام من المعالجة بـ DHPG، تقلص حجم الشجرة التغصنية بشكل كبير. وبخلاف المعالجة بـ PMA، ظهرت العديد من الفروع الجانبية الدقيقة والقصيرة جداً على التغصنات الأولية والثانوية.

تُظهر القياسات الكمية هنا أن كلاً من حجم الشجرة التغصنية في الرسم البياني الشريطي العلوي وعدد نقاط التفرع في الرسم البياني الشريطي السفلي قد انخضا بشكل كبير بعد المعالجة بـ PMA أو DHPG، وكانت الفروق بين الأشجار التغصنية في مجموعة الضبط والأشجار التغصنية لخلايا Purkinje من المزارع المعالجة ذات دلالة إحصائية. وعقب هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق إضافية مثل الفيزيولوجيا الكهربائية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل التبعات الوظيفية لتغير مورفولوجيا الشجرة التغصنية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مزارع شرائح المخيخ العضوية، وكيفية تحليل خلايا Purkinje والمورفولوجيا.