تقييم التغيرات الأيضية الكبدي خلال الاستعمار التدريجي الماوس مجانا من جرثومة 1 H NMR الطيفي
December 15th, 2011
ووصف الإجراء الاستعمار التدريجي لمواصلة تقييم تأثيره على المضيف الاستقلاب الكبدي. ويتم رصد الاستعمار غير جراحية من خلال تقييم إفراز البول من الجراثيم التي شاركت في الأيضات الرنين المغناطيسي النووي القائم على التنميط الأيضية في حين يتم تقييم استقلاب كبدي بواسطة عالي الدقة ماجيك غزل زاوية (ماس HR) الرنين المغناطيسي النووي التنميط من الخزعة سليمة.
الهدف من هذا الإجراء هو تقييم تأثير الاستعمار التدريجي على التمثيل الغذائي الكبدي المضيف. يتم تحقيق ذلك عن طريق استعمار الفئران الخالية من الجراثيم بشكل تدريجي. تتم مراقبة عملية الاستعمار من خلال تقييم الإفراز البولي للمستقلبات الميكروبية المشتركة من خلال التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
بعد مراقبة عملية الاستعمار ، يتم جمع خزعة الكبد من الفأر وإعدادها للتنميط الأيضي. يمكن بعد ذلك الحصول على المظهر التمثيلي الأيضي الكبدي من الخزعة السليمة باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي بزاوية سحرية عالية الدقة غير مدمرة. في النهاية ، يكشف هذا الاستخدام للتحليل الطيفي للبروتون بالرنين المغناطيسي النووي عن العديد من المستقلبات المشاركة في مسارات التمثيل الغذائي مثل مسارات الطاقة والإجهاد التأكسدي.
لذلك يمكن أن توفر هذه التجربة نظرة ثاقبة لوظائف الكبد أثناء الاستعمار. يمكن أيضا تطبيقه من خلال نظام مثل الكلى. لاستعمار ، قم بإزالة الفئران الخالية من الجراثيم من العوازل ووضعها في غرفة تربية تقليدية في أقفاص ، مجهزة بمرشح أمام التقليدية التي تعمل كعناصر تحكم.
ثم امزج نصف القمامة التي يبلغ عمرها ثلاثة أيام مأخوذة من القفص التقليدي للتحكم مع فضلات الحيوانات الخالية من الجراثيم ، وجمع البول في أنبوب صغير سعة 1.5 مليلتر عن طريق التعامل مع الماوس فوق الأنبوب والمساعدة عن طريق تدليك الأمعاء بلطف. مطلوب ما لا يقل عن 20 ميكرولترا للاقتناء باستخدام مسبار الرنين المغناطيسي النووي بمقدار خمسة ملليمترات ، ولكن يوصى باستخدام 30 ميكرولترا لتحسين جودة التنميط الأيضي. قم بتجميد البول على الفور في تخزين النيتروجين السائل على الأقل 40 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل الرنين المغناطيسي النووي.
قبل الحصول على الرنين المغناطيسي النووي ، قم بإعداد محلول عازل لفوسفات الصوديوم 0.2 مولار في الماء الثقيل. الرقم الهيدروجيني 7.4 الذي يحتوي على ملعقة صغيرة ملليمولية واحدة يخلط 30 ميكرولتر من البول مع 30 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم. انقل 50 ميكرولترا من المحلول المختلط إلى أنبوب شعري بالرنين المغناطيسي النووي 1.7 ملم باستخدام حقنة زجاجية سعة 50 ميكرولتر مزودة بإبرة معدنية.
احرص على تجنب الفقاعات. قم بتركيب المحول الشعري أعلى الشعيرات الدموية التي تحتوي على عينة البول وضعها في أنبوب دقيق بالرنين المغناطيسي النووي مقاس 2.5 ملم لمسبار الرنين المغناطيسي النووي بمقدار خمسة ملليمترات. يمكن استخدام هذا المزيج من الأنابيب كأنبوب قياسي بالرنين المغناطيسي النووي خمسة ملليمترات لاكتساب الطيف.
في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام مطياف الرنين المغناطيسي النووي المتقدم بثلاثة 700 ميغاهرتز لجمع البيانات. الحصول على بروتون أحادي البعد الرنين المغناطيسي النووي أطياف باستخدام المعلمات التي تمت مناقشتها في البروتوكول المكتوب. بعد الحصول على الرنين المغناطيسي النووي ، استخدم قضيب الاستخراج لإزالة الشعيرات الدموية من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي 2.5 ملم عن طريق شد المحول الشعري برفق لسحبه للخارج بعد القتل الرحيم للحيوانات كما تمت مناقشته في البروتوكول المكتوب.
استعد لخزعة الكبد. لا تستخدم أي منتج يحتوي على الكحول لتجنب التلوث واغسل الأدوات باستخدام الماء أو المحلول الملحي. اجمع خزعات الكبد من الفص الأيسر لإجراء خزعات قابلة للتكرار.
اجمعها باستمرار في وسط الفص الأيسر، وتجنب المناطق الطرفية حيث تكون الأنسجة أرق. احرص على عدم ثقب المرارة في حالة تسرب الصفراء. اغسل الأنسجة على الفور بالماء أو المحلول الملحي.
قم بتجميد الخزعات في النيتروجين السائل على الفور وقم بتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل الرنين المغناطيسي النووي لإعداد H-R-M-A-S-N-M-R ، أدخل الخزعة الثالثة في دوار الزركونيوم واملأ باقي الحجم بالماء الثقيل النقي لقفل الرنين المغناطيسي النووي. احرص على عدم عمل أي فقاعات لأنها يمكن أن تغير جودة التلطيخ اللاحق والحصول على البيانات. أدخل فاصل تفلون سعة 50 ميكرولتر باستخدام المسمار الأسطواني.
قم بفكه ومعايره باستخدام مقياس العمق على الجانب القصير. ضع دبوس الخيط على الفاصل وقم بلفه برفق بمفك البراغي. منزل جاف ، أي ماء متبقي مع قطعة من الأنسجة.
بعد ذلك ، ضع الغطاء في الجزء العلوي من الدوار وأدخله في عبوة الدوار. اضغط بقوة حتى يصبح الغطاء في مكانه. يجب ألا يكون هناك أي مسافة متبقية بين الدوار وعلامة الغطاء الخاصة به نصف الجزء السفلي من الدوار باستخدام قلم تحديد أسود للسماح باكتشاف معدل الدوران البصري.
بمجرد تعبئة الدوار بشكل كاف ، ضعه داخل مطياف الرنين المغناطيسي النووي وابدأ في الدوران لأعلى خمسة كيلو هرتز. هنا. يتم استخدام مطياف برو متقدم بثلاثة 500 ميغاهيرتز. الحصول على طيف الرنين المغناطيسي النووي للبروتون باستخدام تسلسل نبضات CP MG.
وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ، يمكن استخدام ذروة الجلوكوز المزدوجة الوفيرة ألفا والرقمي عند 5.22 جزءا في المليون لمعايرة أطياف الرنين المغناطيسي النووي الناتجة. لتفريغ الدوار ، تابع إزالة الغطاء ، باستخدام مزيل الغطاء ، وفك دبوس الخيط ، وقم بإزالة فاصل التفلون. باستخدام المسمار الأسطواني ، يمكن غسل الجهاز جيدا باستخدام الماء والمنظفات.
يتضح ظهور مستقلبات الأمعاء الميكروبية المشتركة خلال عملية الاستعمار بوضوح في طيف البروتون هذا لملف التمثيل الغذائي البولي لحيوان مستعمر لمدة 20 يوما. لم يفرز هذا أي كبريتات سهلة الانقياد وكميات صغيرة جدا من فينيل أسيتيل جلايسين ، اختصار PAG وكبريتات الخلية que في الحالة الخالية من الجراثيم. مع تقدم الاستعمار ، تزداد هذه العلامات الثلاث لعملية التمثيل الغذائي للبروتين بواسطة ميكروبات الأمعاء بشكل كبير وتصل إلى التوازن في اليوم 20.
من خلال دمج ذروة PAG الثلاثية المحددة ، كان من الممكن تحديد الزيادة في هذه العلامة المعينة بمرور الوقت. يمثل هذا الرسم البياني متوسط تركيز PAG أثناء الاستعمار لمجموعة من سبعة باستخدام التحليل الطيفي للبروتون H-R-M-A-S-N-M-R ، وهو المظهر الأيضي الكبدي لفأرين قبل وبعد الاستعمار. يوضح هذا الشكل جيدا المعلومات التي يمكن اشتقاقها من ملف تعريف التمثيل الغذائي القائم على A-M-A-S-N-M-R.
يمكن تصور العديد من الأحماض الأمينية وكذلك نواتج الأيض المشتقة من التمثيل الغذائي النشط. تحتوي هذه الملفات أيضا على معلومات ذات صلة بالإجهاد التأكسدي واستقلاب النيوكليوتيدات واستقلاب أمين الميثيل. في هذا المثال ، من الواضح جدا أن الفأر الخالي من الجراثيم لا يعرض أي جليكوجين تقريبا وكميات منخفضة جدا من الجلوكوز والدهون الثلاثية.
لذلك باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق أدوات إحصائية متعددة مثل العلاج الكيميائي من أجل تجميع العينات المنطقية وفقا لملف التمثيل الغذائي ، وتسليط الضوء على المؤشرات الحيوية المرتبطة بحالة التمثيل الغذائي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه الدراسة إجراءً تدريجيًا للاستعمار لتقييم آثاره على التمثيل الغذائي لكبد المضيف. يتم مراقبة الاستعمار بطريقة غير توغلية من خلال إفراز البول لمرافقات التمثيل الغذائي الميكروبية باستخدام التنميط الأيضي القائم على الرنين النووي المغناطيسي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التمثيل الغذائي
- علم الأحياء الدقيقة
الخلفية
- فهم تأثير الميكروبيوم المعوي على التمثيل الغذائي للمضيف أمر بالغ الأهمية.
- تقنيات المراقبة غير التوغلية ضرورية لتقييمات دقيقة.
- توفر تقنية الرنين النووي المغناطيسي تنميطًا أيضيًا مفصلًا.
- يمكن أن يكشف الاستعمار التدريجي عن رؤى حول المسارات الأيضية.
هدف الدراسة
- لتقييم تأثير الاستعمار التدريجي على التمثيل الغذائي الكبدي.
- لمراقبة إفراز المرافقات الأيضية الميكروبية في البول.
- لتحليل خزعات الكبد للتنميط الأيضي باستخدام الرنين النووي المغناطيسي.
الطرق المستخدمة
- استعمار تدريجي للفئران الخالية من الجراثيم.
- تقييم إفراز البول للمرافقات الأيضية الميكروبية عبر تقنية الرنين النووي المغناطيسي.
- جمع خزعات الكبد للتنميط الأيضي.
- استخدام تقنية الرنين النووي المغناطيسي الدوراني بزاوية سحرية عالية الدقة (HR MAS) لتحليل الخزعات السليمة.
النتائج الرئيسية
- تحديد مختلف المرافقات الأيضية المشاركة في مسارات الطاقة والإجهاد التأكسدي.
- مراقبة ناجحة للاستعمار من خلال تحليل المرافقات الأيضية في البول.
- رؤى حول العلاقة بين الميكروبيوم المعوي والتمثيل الغذائي الكبدي.
- تبيين تقنيات التنميط غير المدمرة للدراسات الأيضية.
الخلاصات
- يؤثر إجراء الاستعمار التدريجي بشكل فعال على التمثيل الغذائي الكبدي.
- تعتبر التقنيات القائمة على الرنين النووي المغناطيسي قيمة لدراسة التفاعلات الأيضية.
- قد تستكشف الأبحاث الإضافية الآثار العلاجية للميكروبيوم على التمثيل الغذائي.
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
Understanding host-microbiota metabolic interactions is critical for de-risking therapeutic targets in metabolic disease. This method enables non-destructive, longitudinal assessment of hepatic metabolic shifts during progressive gut colonization, providing mechanistic insights for target validation. It supports predictive confidence in early discovery by linking microbial activity to host pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracking microbial co-metabolite excretion as a functional readout of gut microbiota activity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through longitudinal monitoring of colonization impact on hepatic energy and oxidative stress pathways.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating microbial establishment with measurable shifts in glucose, glycogen, and triglyceride levels in intact liver tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems for downstream screening by establishing reproducible colonization models with quantifiable urinary biomarkers.
- Quantitative Output: Provides semi-quantitative metabolic profiling of intact liver biopsies via HR MAS NMR, enabling detection of key metabolites in energy and stress pathways.
- Platform Reuse: The NMR-based approach can be applied to other tissues (e.g., kidney), supporting cross-organ metabolic profiling in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models metabolic syndrome risk by revealing how progressive colonization alters hepatic metabolism in germ-free mice.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase microbial metabolite tracking to preclinical validation of host metabolic responses.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway-level interactions between gut microbiota and host hepatic function, reducing ambiguity in target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative assessment of microbiota-host metabolic interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by monitoring urinary excretion of microbial co-metabolites (e.g., phenyl acetyl glycine) as colonization progresses.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized, non-invasive monitoring of colonization using NMR-based urinary metabolic profiling.
- Analytics: Delivers quantitative metabolic readouts from intact liver biopsies, including glucose, glycogen, triglycerides, and oxidative stress markers, to compare metabolic states.
- Translational Research: Links microbial metabolic activity to hepatic pathway modulation, supporting preclinical continuity in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reproducible, non-destructive NMR workflow applicable across tissue types for metabolic profiling in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in host-microbiota metabolic interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through non-invasive colonization monitoring and intact tissue profiling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked biomarkers of metabolic pathway engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated hepatic metabolic responses to colonization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, germ-free animal handling, and metabolic profiling techniques.
- Dependent on HR MAS NMR instrumentation, capillary sample preparation tools, and cryogenic storage for urine and tissue samples.
- Necessitates cross-team standardization between microbiology, metabolomics, and pathology teams for consistent sample collection and analysis.
- Must account for variability in coprophagic behavior and environmental colonization when adapting to different model systems or facilities.
- Limited by the semi-quantitative nature of HR MAS NMR and the need for careful bubble-free sample preparation to ensure spectral quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Colonization of Germ-free Animals and Sample Collection
2:07
1H NMR Acquisition of Urine Microvolume
3:25
Collection of Liver Biopsy
4:09
1H High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR of Liver Tissue Biopsy: Sample Preparation
5:55
Urinary and Hepatic Metabolic Profiling through 1H NMR and 1H HR MAS NMR Spectra
7:32
Conclusion
