تقييم التغيرات الأيضية الكبدي خلال الاستعمار التدريجي الماوس مجانا من جرثومة ¹ H NMR الطيفي

الهدف من هذا الإجراء هو تقييم تأثير الاستعمار الميكروبي التدريجي على عملية التمثيل الغذائي الكبدي للمضيف. ويتم تحقيق ذلك من خلال استعمار الفئران الخالية من الجراثيم تدريجياً في البداية. وتتم مراقبة عملية الاستعمار عن طريق تقييم الإفراز البولي للمستقلبات الميكروبية المشتركة باستخدام مطيافية NMR.

بعد مراقبة عملية الاستعمار، يتم جمع خزعة من كبد الفأر وتحضيرها لإجراء التنميط الأيضي. ومن ثم، يمكن الحصول على الملف الأيضي الكبدي من الخزعة السليمة باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي ذات الدوران بزاوية سحرية عالية الدقة وغير المدمرة. وفي النهاية، يكشف استخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للبروتونات عن نواتج أيضية مختلفة تشارك في مسارات أيضية مثل مسارات الطاقة والإجهاد التأكسدي.

يمكن لهذه التجربة أن توفر نظرة متعمقة حول وظائف الكبد أثناء الاستعمار. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل الكلى. لاستعمار الحيوانات، يتم إخراج الفئران الخالية من الجراثيم من العوازل وإيواؤها في غرفة تربية تقليدية داخل أقفاص، مجهزة بمرشح أمام الحيوانات التقليدية التي تعمل كمجموعات ضابطة.

بعد ذلك، اخلط نصف بطن عمره ثلاثة أيام مأخوذ من القفص التقليدي الضابط مع بطن الحيوانات الخالية من الجراثيم. اجمع البول في أنبوب ميكرو سعة 1.5 milliliter عن طريق إمساك الفأر فوق الأنبوب والمساعدة على التبول عن طريق تدليك الأمعاء بلطف. يلزم توفر 20 microliters كحد أدنى للاستحواذ باستخدام مسبار NMR بسعة خمسة millimeter، ولكن يوصى باستخدام 30 microliters لتحسين جودة التوصيف الأيضي. قم بتجميد البول فوراً بالتجميد السريع في النيتروجين السائل، ويحفظ في درجة حرارة لا تزيد عن minus 40 degrees Celsius حتى إجراء تحليل NMR.

قبل بدء عملية الحصول على رنين المغناطيسي النووي (NMR)، قم بتحضير محلول منظم من فوسفات الصوديوم بتركيز 0.2 مولار في ماء ثقيل، وبدرجة حموضة pH 7.4 يحتوي على 1 ملي مولار من TSP. اخلط 30 ميكرولتر من الثيورين مع 30 ميكرولتر من محلول منظم فوسفات الصوديوم. انقل 50 ميكرولتر من المحلول المخلوط إلى أنبوب شعري للرنين المغناطيسي النووي بقطر 1.7 مليمتر باستخدام سرنجة زجاجية سعة 50 ميكرولتر مجهزة بإبرة معدنية.

احرص على تجنب تكون الفقاعات. قم بتركيب محول الشعيرة فوق الشعيرة التي تحتوي على عينة البول، ثم ضعها داخل أنبوب NMR دقيق بحجم 2.5 millimeter مخصص لمسبار NMR بحجم خمسة millimeter. يمكن استخدام هذه التشكيلة من الأنابيب كأنبوب NMR قياسي بحجم خمسة millimeter لعملية الحصول على الأطياف.

في هذا العرض التوضيحي، يتم استخدام مطياف الرنين المغناطيسي النووي Bruker Avance III بـ 700 megahertz لجمع البيانات. قم بالحصول على أطياف الرنين المغناطيسي النووي للبروتون أحادية البعد باستخدام المعايير المذكورة في البروتوكول المكتوب. بعد عملية الحصول على بيانات NMR، استخدم قضيب الاستخراج لإزالة الشعيرة من أنبوب NMR بقطر 2.5 millimeter عن طريق تدوير محول الشعيرة بلطف لسحبها للخارج، وذلك بعد القتل الرحيم للحيوانات كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

قم بالتحضير لأخذ خزعة من الكبد. لا تستخدم أي منتج يحتوي على الكحول لتجنب التلوث، واغسل الأدوات باستخدام الماء أو المحلول الملحي. اجمع خزعات الكبد من الفص الأيسر لضمان الحصول على خزعات قابلة للتكرار.

قم بالجمع بشكل متسق من مركز الفص الأيسر، مع تجنب المناطق الطرفية حيث تكون الأنسجة أكثر رقة. احرص على عدم ثقب المرارة لتفادي تسرب الصفراء. اغسل الأنسجة فوراً بالماء أو بمحلول ملحي.

قم بتجميد الخزعات تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل فوراً واحفظها في درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى إجراء تحليل NMR. وللتجهيز لـ H-R-M-A-S-N-M-R، ضع الخزعة الثالثة في دوار زركونيوم واملأ بقية الحجم بالماء الثقيل النقي لضبط قفل NMR. احذر من تكوين أي فقاعات لأنها قد تؤثر على جودة عملية الموازنة (shimming) واكتساب البيانات اللاحقة. أدخل فاصل تيفلون بحجم 50 µL باستخدام المسمار الأسطواني.

قم بفكّه ومعايرته باستخدام مقياس العمق على الجانب القصير. ضع مسمار التسنين على الفاصل وقم بربطه برفق باستخدام مفك البراغي. جفف أي مياه متبقية باستخدام قطعة من المناديل الورقية.

بعد ذلك، ضع الغطاء في الجزء العلوي من الدوار وأدخله في أداة تثبيت الدوار. اضغط بقوة حتى يستقر الغطاء في مكانه. يجب ألا تتبقى أي مسافة بين الدوار وغطائه. حدد نصف الجزء السفلي من الدوار باستخدام قلم تحديد أسود للسماح بالكشف الضوئي عن معدل الدوران.

بمجرد حشو الدوار بشكل كافٍ، ضعه داخل مطياف NMR وابدأ في التدوير بتردد 5 kHz. هنا، تم استخدام مطياف Bruker Avance III 500 MHz. قم بالحصول على طيف proton NMR باستخدام تتابع نبضات CPMG.

وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة، يمكن استخدام ذروة الثنائية الغلوكوزية (alpha and numeric glucose doublet peak) الوفيرة عند 5.22 parts per million لمعايرة أطياف NMR الناتجة. لفك الدوار، ابدأ بإزالة الغطاء، وباستخدام أداة إزالة الغطاء، قم بفك مسمار القلاووظ وإزالة فاصل التيفلون. وباستخدام المسمار الأسطواني، يمكن غسل الجهاز جيداً باستخدام الماء والمنظف.

يظهر ظهور المستقلبات المشتركة للميكروبات المعوية بوضوح خلال عملية الاستعمار في طيف البروتون هذا لملف استقلابي بولي لحيوان تم استعماره لمدة 20 يوماً. لم يفرز هذا الحيوان أي indoxyl sulfate وكميات صغيرة جداً من phenyl acetyl glycine، المختصرة بـ PAG و p-cresol sulfate في حالة الخلو من الجراثيم. ومع تقدم الاستعمار، تزداد هذه العلامات الثلاث لاستقلاب البروتين بواسطة ميكروبات الأمعاء بشكل ملحوظ وتصل إلى حالة توازن في اليوم 20.

من خلال تكامل ذروة ثلاثية PAG المحددة، أمكن قياس الزيادة في هذا المؤشر الخاص بمرور الوقت. يمثل هذا المخطط متوسط تركيز PAG أثناء الاستعمار لمجموعة مكونة من سبعة حيوانات باستخدام مطيافية البروتون H-R-M-A-S-N-M-R، حيث تم الحصول على المظهر الأيضي الكبدي لفأرين قبل الاستعمار وبعده. يوضح هذا الشكل بشكل جيد المعلومات التي يمكن استخلاصها من المظهر الأيضي القائم على A-M-A-S-N-M-R.

يمكن تصور العديد من الأحماض الأمينية بالإضافة إلى المستقلبات المشتقة من التمثيل الغذائي الطاقي. كما تحتوي هذه الملفات التعريفية على معلومات ذات صلة بالإجهاد التأكسدي، وتمثيل النيوكليوتيدات، وتمثيل ميثيل الأمين. وفي هذا المثال، يتضح تماماً أن الفأر الخالي من الجراثيم لا يظهر أي جليكوجين تقريباً وكميات منخفضة جداً من الجلوكوز والدهون الثلاثية.

وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تطبيق أدوات إحصائية متعددة مثل الكيمياء التحليلية الإحصائية (chemo) من أجل تجميع العينات المنطقية وفقاً للملف الأيضي، وتسليط الضوء على المؤشرات الحيوية المرتبطة بالحالة الأيضية.