ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية

الهدف العام من التجربة التالية هو إدخال جزيئات أو بروتينات صغيرة مصنفة بالفلورسنت في سيتوبلازم خلية ثدييات مستزرعة ، ومراقبة التغيرات المورفولوجية المستحثة من الميكرومتر إلى دقة النانومتر المتعددة. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة خلايا الثدييات أولا على زلات غطاء زجاجي شبكي وحقنها بجزيء صغير أو بروتين ذي أهمية يحمل علامة فلورسنت. بعد ذلك ، يتم تثبيت الخلايا في الفورمالديهايد ومراقبتها وتصويرها باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

ثم يتم تثبيت الخلايا بالجلوتارالديهايد ، وتقسيمها ، وتلطيخها ، وتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني. أخيرا ، يتم دمج الصور الملتقطة أثناء الفلورسنت الساطع والفحص المجهري الإلكتروني ومحاذاتها. في النهاية ، يسمح ارتباط هذه الصور للباحث بتصوير اضطرابات عالية الدقة يسببها الجزيء الصغير أو البروتين المهم.

مرحبا ، أنا الدكتور إيفان ريديك في مختبر الدكتور نيل ألتو في قسم علم الأحياء الدقيقة في المركز الطبي بجامعة تكساس ساوث وسترن في دالاس. سأتحدث إليكم اليوم عن إجراء M Clem أو الحقن المجهري المترابط للحقن المجهري والمجهري الإلكتروني. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء على التقنيات المستقلة مثل الحقن المجهري أو الفحص المجهري ، هي أنه يتم إجراؤها هنا بشكل متناغم والمساعدة في استخدام زلة غطاء زجاجي شبكية.

إن قسيمة الغطاء الشبكية هذه هي التي تسمح للباحثين بالعودة إلى نفس الخلية خلال أجزاء مختلفة من البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح هذه التقنية للباحث القدرة على مراقبة التغيرات المعمارية تحت الخلوية من مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة أو البروتينات القابلة للحقن ذات الأهمية ، والقيام بذلك من الميكرومتر إلى دقة النانومتر المتعددة. للتحضير للحقن المجهري ، الخلايا مثل الكلى الطبيعية للفئران أو خلايا سرطان عنق الرحم الخالدة على زلات غطاء شبكية زجاجية محفورة بالصور ، يتم لصق طبقين من الخلايا الحية ، يحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

اعتمادا على الجدول الزمني التجريبي المراد استخدامه ، اضبط طلاقة الخلايا. ستجعل اللوحة المتجانسة تماما تحديد الخلايا المحقونة الدقيقة في المجهر الإلكتروني أمرا صعبا للغاية. لذلك ، تصل خلايا البذور إلى حوالي 50٪ من الطلاقة المشتركة في يوم التجربة القصيرة وحوالي 25٪ من الطلاقة.

في يوم التجربة الأطول ، قم بإعداد الحمض النووي البروتيني المسمى بالفلورسنت أو جزيئات صغيرة في المخزن المؤقت المناسب لحجم نهائي يبلغ 50 ميكرولترا. اعتمادا على الفلور ofor الذي تختاره ، أضف صبغة تتبع مثل تكساس الأحمر أو الأزرق المتتالي. أضف تركيزا من 0.5 إلى ملليغرام واحد لكل ملليلتر.

قم بتصفية المحلول من خلال مرشح طرد مركزي 0.22 ميكرون. بعد سحب إبر الحقن المجهري باستخدام إرشادات الشركة المصنعة ، قم بسحب الماصة بعناية للحصول على ميكرولتر من المحلول في الواجهة الخلفية للإبرة. قم بتحميل الإبرة في ذراع المناور الدقيق لجهاز حقن مجهري تجاري متصل بمجهر مقلوب.

ضع طبقا من الخلايا المستنبتة في حامل طبق المجهر المقلوب. ابحث عن الخلايا التي تنمو داخل شبكة محفورة بالصور ولاحظ المعرف الأبجدي الرقمي للشبكات. سيتم استخدام هذا في جميع الخطوات اللاحقة.

من المهم اختيار خلايا الحقن المجهري التي يتم التصاقها بالقرب من مركز زلة الغطاء، وتجنب الخلايا القريبة من المحيط. هذا مهم لأنه سيضمن نقلا فعالا لخلاياك التي تهمك إلى القطعة المركزية لراتنج الإيبون المستخدمة لاحقا في الفحص المجهري الإلكتروني يدوي ، قم بخفض ذراع الحقن يدويا فوق زلة الغطاء واستخدم المناور الصغير لخفض الإبرة حتى يلامس الطرف بلطف سطح الخلايا. حقن Micro كل خلية أخرى داخل الشبكة المختارة للخلايا المزروعة بحوالي 50٪ تتوقع Co الطلاقة حوالي 80 خلية لكل شبكة 600 ميكرومتر مربع ، مما سيعطي N من حوالي 30 إلى 40 خلية تجريبية وخاضعة للرقابة.

بعد الحقن ، ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة للمدة الزمنية المطلوبة لإجراء الفحص المجهري الفلوري. تخلص من وسط النمو وقم بإصلاح الخلايا بالفورمالديهايد في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. استبدل المثبت ب XPBS واحد.

ثم قم بتوثيق ترتيب الخلايا عن طريق التقاط خمس إلى 10 صور ميدانية ساطعة للشبكة المختارة بتكبير منخفض ومرتفع. لتحديد الخلايا المحقونة الدقيقة ، التقط صورا فلورية عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث لعين صبغة الحقن الخاملة. باستخدام المجهر متحد البؤر ، اجمع مجموعة من صور الخلايا المحقونة الدقيقة بتكبير عال داخل نفس الشبكة التي تم تصويرها مسبقا.

هناك حاجة إلى تكبير عال من أجل ربط الصور الفلورية بالهياكل تحت الخلوية التي سيتم تحديدها باستخدام المجهر الإلكتروني. بعد التصوير متحد البؤر ، استخدم سائل إزالة زلة الغطاء لفصل زلة الغطاء عن الطبق ووضعها جنبا إلى جنب مع الخلية في طبق استزراع طازج يحتوي على XPBS واحد. انتقل إلى المعالجة للفحص المجهري الإلكتروني.

كن بعد اتباع بروتوكولات EM القياسية. لإصلاح البقع وتجفيف العينات ، قم بإعداد راتنج الإيبون وضع جانب خلية الغطاء لأسفل فوق أنبوب مملوء براتنج دهون. اترك الراتنج يتبلمر عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

لإزالة زلة الغطاء من راتنج الايبون. اغمره بسرعة في النيتروجين السائل. صدمة درجة الحرارة من 60 درجة مئوية إلى سالب 196 درجة مئوية.

يزيل زلة الغطاء من أنبوب الراتنج. انتظر من خمس إلى 10 دقائق ، ثم استرجع الأنبوب ، الذي أصبح الآن خاليا من زلة الغطاء. تحت نطاق تشريح ، افحص سطح الراتنج لتحديد موقع الشبكة ذات الاهتمام.

باستخدام شفرة حلاقة معقمة أو مشرط ، قم بقص كتلة epon بحيث تكون الشبكة محل الاهتمام فقط في قمة الكتلة باستخدام أقسام تسلسلية مقطوعة فائقة الصغر من الكتلة المشذبة باستخدام أسيتات المبولة وسيترات الرصاص لتباين الأقسام باستخدام البروتوكولات القياسية. انقل الخلايا المرغوبة في المجهر الإلكتروني باستخدام الوضع النسبي للخلايا كدليل. باستخدام صور الفلورسنت عالية الدقة التي تم التقاطها سابقا.

تحديد المناطق ذات الأهمية في الرسم المجهري الإلكتروني التي تتوافق مع إشارة الفلورسنت. استخدم معالمها مثل موضع الكروماتين غير المتجانس والغلاف النووي لتحديد صورة Zack الفلورية التي تتوافق مع شريحة EM. يتم تصويرها حاليا باستخدام برنامج تصوير مثل Image J أو Adobe Photoshop ، مما يقلل من عتامة الصورة الفلورية إلى 50٪ وتراكبها على صورة TEM المقابلة.

قم بمحاذاة الصور عن طريق ضبط المقياس المعروض. فيما يلي نتائج الحقن المجهري والضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني. تظهر هذه الصورة الصورة الصورة المجهرية الساطعة لخلايا NRK التي تنمو على زلة غطاء شبكية زجاجية محفورة بالليزر.

لاحظ أحرف الخلفية b و m المستخدمة لتحديد الشبكة التي تحتوي على خلايا محقونة. تشير الأسهم إلى الخليتين اللتين تم تحديدهما وتصويرهما باستخدام المجهر الإلكتروني. تظهر هنا صورة فلورية لصبغة التتبع الخاملة المتتالية الزرقاء المستخدمة لتحديد الخلايا المحقونة الدقيقة.

فيما يلي تراكب لإشارات المجال الساطع والفلورسنت لجزيء صغير يسمى أمين. تمثل هذه اللوحة الارتباط بين الفلورسنت الساطع والمجهر الإلكتروني للخلية المحقونة. يشير رأس السهم إلى نقطة الفلورسنت المصورة بتكبير أعلى في هذه اللوحة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحقن الدقيق لبروتين محل اهتمام وتتبع تغيراته المورفولوجية تحت الخلوية التي يسببها باستخدام إجراء الحقن المجهري Clem أو الفحص المجهري للضوء والإلكتروني.