ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية

الهدف العام من التجربة التالية هو إدخال جزيئات صغيرة أو بروتينات مُعلمة فلوريسنتياً إلى سيتوبلازم خلية ثديية مستزرعة، ومراقبة التغيرات المورفولوجية المستحثة بدقة تتراوح من الميكرومتر إلى عدة نانومترات. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع الخلايا الثديية على شرائح تغطية زجاجية مُشبكة، ثم حقنها مجهرياً بجزيء صغير أو بروتين مُعلم فلوريسنتياً وهو موضوع الدراسة. بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا في الفورمالدهيد، ومراقبتها وتصويرها باستخدام المجهر الفلوريسنتي.

بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا باستخدام glutaraldehyde، ثم تُقطع إلى شرائح، وتُصبغ، وتُصوَّر باستخدام المجهر الإلكتروني. وأخيراً، يتم دمج ومحاذاة الصور التي تم التقاطها أثناء المجهر الفلوري ذو المجال المضيء والمجهر الإلكتروني. وفي نهاية المطاف، يتيح ربط هذه الصور للباحث تصوير الاضطرابات التي تسببها الجزيئات الصغيرة أو البروتينات المستهدفة بدقة عالية.

مرحباً، أنا الدكتور إيفان ريديك من مختبر الدكتور نيل ألتو في قسم الأحياء الدقيقة بجامعة تكساس ساوث ويسترن سنتر الطبي في دالاس. سأتحدث إليكم اليوم عن إجراء M Clem أو المجهر الضوئي والإلكتروني الارتباطي بالحقن المجهري. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء مقارنة بالتقنيات المستقلة مثل الحقن المجهري أو المجهرية، هي أنه يتم تنفيذها هنا بشكل متضافر وبمساعدة استخدام غطاء شريحة زجاجي محدد بشبكة.

تسمح غطاءات الشرائح ذات الشبكة هذه للباحثين بالعودة إلى الخلية نفسها خلال أجزاء مختلفة من البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، تمنح هذه التقنية الباحث القدرة على ملاحظة التغيرات البنيوية المحفزة في المكونات تحت الخلوية الناتجة عن مجموعة واسعة من الجزيئات الصغيرة القابلة للحقن أو البروتينات المستهدفة، والقيام بذلك بدقة تتراوح من الميكرومتر إلى عدة نانومترات. للتحضير للحقن المجهري، يتم زراعة خلايا مثل خلايا الكلى الطبيعية للجرذان أو خلايا سرطان عنق الرحم الخالدة على غطاءات شرائح زجاجية ذات شبكة محفورة ضوئياً ومثبتة في أطباق الخلايا الحية، ثم تُحضن الخلايا عند 37 °C و 5%CO2.

بناءً على الجدول الزمني التجريبي المستخدم، قم بتعديل درجة تلاقي الخلايا. إذ إن الطبق متراص الخلايا بالكامل سيجعل من الصعب جداً تحديد الخلايا المحقونة مجهرياً باستخدام المجهر الإلكتروني. لذا، قم بزراعة الخلايا بحيث تصل إلى تلاقٍ بنسبة 50% تقريباً في يوم التجربة القصيرة، وحوالي 25% من التلاقي في الحالات الأخرى.

في اليوم المخصص للتجربة الطويلة، قم بتحضير البروتين أو الحمض النووي DNA أو الجزيئات الصغيرة الموُسمة فلورياً في المنظم المناسب حتى يصل الحجم النهائي إلى 50 µL. وبناءً على الفلوروفور المختار، أضف صبغة تتبع مثل Texas red أو cascade blue. أضف تركيزاً يتراوح من 0.5 إلى 1 mg/mL.

قم بترشيح المحلول باستخدام مرشح طرد مركزي بمسامية 0.22 micron. بعد سحب إبر الحقن المجهري وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة، قم بنقل بضع ميكرولترات من المحلول بعناية بواسطة الماصة إلى الجزء الخلفي من الإبرة. ثم قم بتركيب الإبرة في ذراع المانيبولاتور الدقيق الخاص بجهاز حقن مجهري تجاري متصل بمجهر مقلوب.

ضع طبقاً من الخلايا المستنبتة في حامل الأطباق الخاص بالمجهر المقلوب. حدد الخلايا التي تنمو داخل شبكة محفورة ضوئياً ودون المعرف الأبجدي الرقمي لهذه الشبكة؛ حيث سيتم استخدامه في جميع الخطوات اللاحقة.

من المهم اختيار الخلايا المخصصة للحقن المجهري التي تكون ملتصقة بالقرب من مركز غطاء الشريحة، وتجنب تلك الموجودة بالقرب من المحيط. وهذا أمر ضروري لضمان النقل الفعال للخلايا المطلوبة إلى القطعة المركزية من راتنج الإيبون المستخدمة لاحقاً في المجهر الإلكتروني. قم بخفض ذراع الحقن يدوياً فوق غطاء الشريحة واستخدم الموجه الدقيق لخفض الإبرة حتى يلامس طرفها سطح الخلايا برفق. قم بحقن خلية واحدة من كل خليتين ضمن الشبكة المختارة؛ وبالنسبة للخلايا التي نمت بكثافة تبلغ حوالي 50%، يُتوقع وجود حوالي 80 خلية لكل شبكة بمساحة 600 square micrometer، مما سيعطي عدداً (N) يتراوح بين 30 إلى 40 خلية تجريبية وضابطة.

بعد الحقن، يُعاد وضع الطبق في الحاضنةة للمدة المطلوبة لإجراء المجهر الفلوري. يتم التخلص من وسط النمو وتثبيت الخلايا باستخدام formaldehyde في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. استبدل المثبت بـ XPBS واحد.

بعد ذلك، وثّق ترتيب الخلايا من خلال التقاط خمس إلى 10 صور بالحقل المضيء (bright field) للشبكة المختارة بتكبيرات منخفضة وعالية. ولتحديد الخلايا التي تم حقنها مجهرياً، التقط صوراً فلورية عند أطوال موجات الإثارة والانبعاث الخاصة بصبغة الحقن الخاملة. وباستخدام مجهر بؤري (confocal microscope)، اجمع مجموعة من الصور (Z-stack) للخلايا المحقونة مجهرياً بتكبير عالٍ ضمن نفس الشبكة التي تم تصويرها سابقاً.

يلزم استخدام تكبير عالٍ من أجل ربط الصور الفلورية بالبنى تحت الخلوية التي سيتم تحديدها باستخدام المجهر الإلكتروني. بعد التصوير البؤري، استخدم سائل إزالة غطاء الشرائح لفصل غطاء الشرائح عن الطبق، وضعه بحيث تكون جهة الخلايا للأعلى في طبق زراعة جديد يحتوي على XPBS واحد. انتقل بعد ذلك إلى مرحلة المعالجة للمجهر الإلكتروني.

اتبع بروتوكولات المجهر الإلكتروني (EM) القياسية. لتثبيت صبغ وتجفيف العينات، قم بتحضير راتنج الإيبون (epon resin) وضع غطاء الشريحة بحيث تكون جهة الخلية لأسفل فوق أنبوب مملوء براتنج الإيبون. اترك الراتنج ليتبلمر عند درجة حرارة 60 °C لمدة 24 ساعة.

لإزالة غطاء الشريحة من راتنج الإيبون، اغمرها سريعاً في النيتروجين السائل؛ حيث يؤدي الصدم الحراري من 60 °C إلى -196 °C إلى فصل الغطاء.

قم بإزاحة غطاء الشريحة من أنبوب الراتنج. انتظر من خمس إلى 10 دقائق، ثم استعد الأنبوب الذي أصبح الآن خالياً من غطاء الشريحة. وتحت مجهر تشريحي، افحص سطح الراتنج لتحديد موقع الشبكة المطلوبة.

باستخدام شفرة حلاقة معقمة أو مشرط، قم بتقليم كتلة الـ epon بحيث تكون الشبكة المستهدفة فقط هي الموجودة في قمة الكتلة، ثم استخدم الميكروتوم فائق الدقة (ultra microtone) لقطع مقاطع متسلسلة من الكتلة المقلمة. استخدم خلات اليورانيل وسيترات الرصاص لتتباين المقاطع وفقاً للبروتوكولات القياسية. حدد موقع الخلايا المطلوبة في المجهر الإلكتروني باستخدام التموضع النسبي للخلايا كدليل، وبالاستعانة بصور الفلورسنت عالية الدقة التي تم التقاطها مسبقاً.

حدد المناطق ذات الأهمية في الصورة المجهرية الإلكترونية التي تتوافق مع الإشارة الفلورية. استخدم علامات استدلالية، مثل موضع الكروماتين المغاير والغلاف النووي، لتحديد أي صورة فلورية لـ Zack تتوافق مع الشريحة المقطعية للمجهر الإلكتروني. أثناء العرض باستخدام برنامج تصوير مثل Image J أو Adobe Photoshop، قلل تعتيم الصورة الفلورية إلى 50% وقم بتركيبها فوق صورة TEM المقابلة.

قم بمحاذاة الصور عن طريق ضبط المقياس الموضح. فيما يلي النتائج المستخلصة من الحقن المجهري والمجهر الضوئي والإلكتروني المترابط. تعرض هذه الصورة صورة مجهرية بالحقل المضيء لخلايا NRK تنمو على شريحة غطاء زجاجية ذات شبكة محفورة بالليزر.

لاحظ أحرف الخلفية b و m المستخدمة لتحديد الشبكة التي تحتوي على الخلايا المحقونة. تشير الأسهم إلى الخليتين اللتين تم تحديدهما وتصويرهما باستخدام المجهر الإلكتروني. تظهر هنا صورة فلورية لصبغة التتبع الخاملة cascade blue المستخدمة لتحديد الخلايا المحقونة مجهرياً.

فيما يلي تراكب للإشارات الناتجة عن المجال المضيء والفلورة لجزيء صغير مُوسوم بالأمين. تمثل هذه اللوحة الارتباط بين المجهر المضيء والفلوري والمجهر الإلكتروني لخلية تم حقنها. يشير رأس السهم إلى نقاط فلورية تم تصويرها بتكبير أعلى في هذه اللوحة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية الحقن المجهري لبروتين معين وتتبع التغيرات المورفولوجية تحت الخلوية التي يحدثها، وذلك باستخدام إجراء الحقن المجهري بتقنية Clem أو المجهر الضوئي والإلكتروني الترابطي.