تأمين تدفق الأحماض النووية الخلوي ومضان في الموقع التهجين (LNA تدفق FISH) : طريقة لاكتشاف الحمض النووي الريبي البكتيرية الصغيرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن تعبير الحمض النووي الريبي (RNA) البكتيري في الخلايا البكتيرية الفردية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصميم مسبار من الحمض النووي الموصد (LNA) مع تعديل biotin TEG عند الطرف الخماسي (5'). وإذا تم تثبيت الخلايا البكتيرية بعد ذلك، ومعالجتها بـ dathyl أو percarbonate أو dsy ثم نفاذيتها، يتم مسخ الـ RNA وتهجين مسبار LNA.

ثالثاً، يتم غسل الخلايا، وحجبها، وصبغها. وأخيراً، يتم قياس الفلورة الخلوية عن طريق قياس التدفق الخلوي. وفي نهاية المطاف، يمكن تقييم التغيرات في تعبير RNA بمرور الوقت وضمن المجموعات السكانية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بمدى الوجود والوفرة النسبية لأنواع RNA داخل خلية واحدة، والدرجة التي يتغير بها هذا التعبير ضمن المجموعات المتجانسة أو غير المتجانسة. ورغم أن هذه الطريقة تُستخدم حالياً لمراقبة تعبير RNA الصغير البكتيري، إلا أنه يمكن نظرياً استخدامها للكشف عن RNA في أي نوع من الخلايا تقريباً. بعد تصميم تسلسل مسبار LNA، استخدم blast للتأكد من أن المسبار متخصص فقط لـ SRNA أو mRNA المستهدف.

عند طلب المسبار، أضف تعديلاً بواسطة biotin TEG إلى الطرف الخماسي (5') من قليل النيوكليوتيد LNA. يعد ارتباط البيوتين ضرورياً لعملية الصبغ بعد التهجين باستخدام conjugate من streptavidin و di. يجب تضمين ثلاث ضوابط سلبية في الطريقة، منها الضابط (1A) "بدون LNA"، والذي لا يتم فيه إضافة مسبار LNA أثناء عملية التهجين.

الخطوة الثانية، ضابط سلبي للصبغة يتم فيه تهجين مسبار LNA مع SRNA المستهدف، ولكن لا يتم الكشف عن عملية التهجين بسبب غياب الصبغة الفلورية. والثالثة، ضابط لـ SRNA أو mRNA غير مُعبَّر عنه يستخدم مسبار LNA يستهدف SRNA غير موجود أو غير مُعبَّر عنه لمراقبة التهجين غير النوعي؛ ابدأ بحصد 1×10⁸ من خلايا البكتيريا المعنية ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. ثم قم بترسيب الخلايا البكتيرية عند 2300 ×g لمدة خمس دقائق بعد الطرد المركزي.

قم بإزالة السائل الطافي باستخدام الماصة وليس عن طريق الصب. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب في 400 µL من PBS، ثم أضف 400 µL من محلول تثبيت A PFA acetic acid PBS وامزج الخلايا جيداً. الآن، قم بحضن المعلق لمدة 10 دقائق عند 25 °C.

يتم الرج الدوامي مرة واحدة بعد مرور خمس دقائق من عملية طرد الخلايا مركزياً مرة أخرى، وهذه المرة بسرعة 4,500 ×g لمدة دقيقتين. يتم غسل الراسب مرتين باستخدام 400 µL من PBS.

أخيرًا، أعد تعليق الراسب في 400 µL من PBS وخزن الخلايا المثبتة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى سبعة أيام. ابدأ بإضافة 400 µL من محلول 1%dsy المحضر حديثًا إلى كل عينة من الخلايا البكتيرية المثبتة. ثم امزج محاليل الخلايا جيدًا باستخدام الماصة.

قم بتحضين هذا الخليط لمدة 12 دقيقة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية، وبعد ذلك، وبعد غسل الخلايا مرتين باستخدام 400 µL من PBS، أضف 800 µL من محلول lysozyme المُحضّر حديثاً إلى الخلايا. اخلط محلول lysozyme والخلايا جيداً باستخدام جهاز vortex، ثم حضّن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية مع التقليب من حين لآخر. بعد ترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، أضف 800 µL من محلول proteinase K المُحضّر حديثاً إلى الراسب، واخلط محلول الخلايا المعاد تعليقه جيداً باستخدام الماصة.

قم بتحضين الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 25 °C، مع استخدام جهاز الـ vortex في منتصف فترة التحضين. بعد إجراء عملية الطرد المركزي وغسل الخلايا باستخدام 400 µL من PBS، أعد تعليق الخلايا في 400 µL أخرى من PBS، ثم أضف 100 µL من المعلق في أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL منفصلة، وبعد ذلك قم بترسيب الخلايا وتخلص من السوائل الطافية. الآن، قم بتحضين العينات الأربعة جميعها في 100 µL من محلول التهجين (hybridization buffer) لكل منها عند 60 °C لمدة 60 دقيقة. بعد عملية التهجين، أضف 1 mL من SSC plus tween 20 أو SSCT إلى خليط التهجين للسماح بإزالة الخلايا من محلول التهجين اللزج.

بعد تجميع الخلايا في كريات، أضف 200 µL من محلول form amide SSCT إلى الكريات واخلط جيداً. ثم حضّن العينات لمدة 30 دقيقة عند 65 °C في وحدة تسخين. الآن أضف 1 mL من SSCT إلى المزيج، وبعد تجميع الخلايا في كريات مرة أخرى، أعد تعليق الخلايا في 500 µL من SSCT وحضّن محلول الخلايا لمدة 40 دقيقة على وحدة التسخين.

بعد الترسيب، أضف 200 µL من محلول الحجب (blocking buffer) إلى كرات الخلايا المهجنة، ثم قم بتحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 25 °C. بعد الترسيب مرة أخرى، أضف 50 µL من محلول avid المزال منه الصبغ والصبغة إلى كرات الخلايا وقم بخلط الخلايا جيداً من أجل مجموعة الضبط الخالية من الصبغة (no dye control). أضف 50 µL من محلول الحجب.

قم بحضن جميع العينات لمدة 12 دقيقة إضافية عند 25 درجة Celsius مع خلط مستمر في جهاز thermo mixer، مع حماية الأنابيب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. بعد ذلك، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 500 microliters من محلول SSCT buffer ومرة واحدة باستخدام 400 microliters من PBS plus tween 20 أو PBST. بعد إزالة السوائل الطافية، أضف 100 microliters من biotinylated antis، و strippin و PBS لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة Celsius مع الخلط من حين لآخر؛ حيث سيرتبط هذا الجسم المضاد بـ strippin DI conjugate الذي تم إدخاله في الخطوة السابقة.

بعد ذلك، وبعد تجميع الخلايا في كرات (pelleting) وغسلها مرتين باستخدام 400 µL من PBST، يتم إجراء الصبغ مرة ثانية عن طريق إضافة 50 µL من محلول dye-avid المجرد إلى الخلايا مع الخلط جيداً. تزيد هذه الخطوة من مخرجات الإشارة لكل مسبار LNA مهجن بالنسبة لعينة التحكم الخالية من الصبغة (no dye control). مرة أخرى، أضف 50 µL من محلول الحجب (blocking buffer) فقط، ثم حضن جميع الأنابيب لمدة 12 دقيقة عند 25 °C مع الخلط المستمر في جهاز thermo mixer.

بعد التحضين مع محلول الصبغة، اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام 500 µL من محلول SSCT المنظم، ثم اغسلها مرة واحدة باستخدام 400 µL من محلول PBST بعد عملية الغسيل الثانية. أعد تعليق الراسب في 200 µL من محلول PBST وخزن الخلايا عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين وقت تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي؛ وبالنسبة للخلايا البكتيرية الصغيرة، اضبط معدل التدفق في جهاز قياس التدفق الخلوي على سرعة منخفضة لتقليل حجم النواة. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة لأجهزة قياس التدفق الخلوي التي تحتوي على حدود قطع للتشتت الأمامي، اضبط حد القطع على أدنى قيمة ممكنة لضمان اكتشاف الخلايا البكتيرية الصغيرة.

يظهر هنا مثال لخلايا تم تثبيتها ونفاذها بشكل فعال في مخطط النقاط لتقنية قياس التدفق الخلوي عند استخدام الظروف المذكورة للتو. بالنسبة للنفاذ، فإن مجموعة الخلايا صغيرة ومتجانسة، مما يشير إلى وجود عدد قليل من تجمعات الخلايا. ومع ذلك، عند استخدام تركيزات أعلى من lysozyme، تزداد احتمالية تجمع الخلايا وإظهار قيم تشتت أمامي متزايدة تشير إلى جزيئات أكبر، كما هو موضح في مخطط النقاط هذا.

يظهر هنا مثال لبيانات قياس التدفق الخلوي من تجربة flow fish ناجحة باستخدام LNA. يوضح المخطط التكراري الكشف النوعي عن SRNA مستهدف إلى جانب ثلاث ضوابط سلبية. يُظهر الضابط السلبي (بدون صبغة) باللون الأرجواني أقل قدر من الفلورة، يليه الضابطان السلبيان (بدون LNA) و(SRNA غير مُعبّر عنه) باللونين الأزرق والأحمر على التوالي.

وفي النهاية، تعطي العينة التي تحتوي على مسبار LNA النوعي لـ SRNA أعلى فلورة باللون الأسود. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ست ساعات تقريباً إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه التقنية معلومات أكثر وهي أكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة بـ R-T-P-C-R.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن وسم مجسات إضافية باستخدام HAPS أخرى وإضافتها أثناء خطوة التهجين لتمكين الكشف المتعدد لـ RNA.