تحضير العينة من المتفطرة السلية خلاصات لدراسات النووية المغناطيسي الرنين Metabolomic
سبتمبر 3, 2012
الملف الشخصى metabolomic من المتفطرة السلية يتم تحديد بعد النمو في الثقافات مرق. يمكن أن تختلف الشروط لاختبار تأثير من المكملات الغذائية، تأكسد، والأدوية المضادة للسل على الملف الشخصي لهذا التمثيل الغذائي الكائنات الحية الدقيقة. إجراءات إعداد مستخلص ينطبق على حد سواء 1D 1 H و 2D 1 H- 13 C NMR التحليلات.
الهدف من هذا الإجراء هو تحليل المتفطرة السلية ، والمستخلصات الخالية من الخلايا بواسطة استقلاب الرنين المغناطيسي النووي ، وزراعة الخلايا في مرحلة مناسبة من النمو. ثم خلايا ليزا والحصول على مستخلصات خالية من الخلايا لتحليلها. أعد تعليق المستخلصات المجففة بالتجميد في المخزن المؤقت لتحليل الرنين المغناطيسي النووي.
أخيرا ، اجمع بيانات الرنين المغناطيسي النووي وقم بتحليل الأطياف باستخدام برنامج لتحديد المستقلبات. في النهاية ، يتم استخدام تحليل الرنين المغناطيسي النووي لبكتيريا السل المتفطرة لإظهار الحفظات في مستويات المستقلب عند العلاجات المختلفة. يمكن تطبيق التمثيل الغذائي بالرنين المغناطيسي النووي على الجوانب الرئيسية لفسيولوجيا المتفطرة السلية ، مثل مسارات التمثيل الغذائي المهمة.
هذا الفهم أمر بالغ الأهمية لتوضيح آليات عمل عمل الدواء ومقاومته وتحديد أهداف جديدة لتصميم الأدوية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب عدم القدرة على التعامل مع جميع العينات بنفس الطريقة تماما ، مما سيؤدي إلى اختلافات ونتائج غير ضرورية من مختبري. ستيفن لوكا ، دكتوراه ، طالب دراسات عليا سيوضح إجراءات التعامل مع العينات لمعالجة الرنين المغناطيسي النووي من مختبري ، سيوضح مدير مختبر الأبحاث وروبرت فينتون ، فني الأبحاث الثالث ، إجراءات التعامل مع مزارع السل الفطرية عند إجراء مرض السل M.
اتبعت البحوث ممارسات السلامة الأحيائية من المستوى الثالث على النحو المحدد في المبادئ التوجيهية المؤسسية. على الرغم من أن الملصقات الموجودة في هذا الفيديو تقول بكتيريا السل الدقيقة لاعتبارات السلامة الحيوية ، إلا أن هذا العرض التوضيحي استخدم المتفطرة الصهارية غير المسببة للأمراض. ابدأ بإذابة مخزون الجلسرين بنسبة 50٪ من مرض السل M على الجليد.
قم بتلقيح 0.15 مل إلى 110 مل من مرق M-A-D-C-T-W في 250 مليلتر من ER وتنمو القارورة الخاصة بي الثقافات عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة ستة أيام تقريبا. إذا لم تكن هناك حاجة إلى مضادات حيوية أو إضافات بديلة أو علاجات أخرى. حصاد الثقافات للثقافات التي تتطلب علاجات.
احتفظ ب 0.5 مل Eloqua على الجليد للاستزراع والمعايرة بالتحليل الحجمي ومراقبة الجودة. ثم قم بإجراء العلاج المطلوب وأعد الثقافات إلى الخلاط بعد فترة العلاج الزمنية. قم بإزالة مليلتر واحد وتحديد OD 600.
أيضا ، احتفظ بعينة 0.5 مل للاستزراع والمعايرة بالتحليل الحجمي ومراقبة الجودة. حافظ على الخلايا على الجليد طوال البروتوكول المتبقي بالكامل. احصد الخلايا في أربعة أنابيب سعة 50 مليلتر عن طريق الطرد المركزي بعد غسلها ب 15 مليلتر من الماء المقطر المزدوج المثلج.
ريس يعلق الكريات في 10 ملليلتر. اسحب اثنين من الحبيبات والحبيبات عن طريق الطرد المركزي ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في حجم نهائي من مليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج. إذا كان هناك حاجة إلى تعليق خلية واحدة خال من التكتل ، فقم بتمرير الخلايا عبر إبرة قياس 27.
تابعثلاث مرات نقل تعليق الخلية المليلتر الواحد إلى غطاء لولبي بسعة ملليلترين يحتوي على مصفوفة التحليل B.Position المجانس التحلل 24 السريع داخل خزانة السلامة الحيوية. ضع العينات في حامل العينة الذي يؤمن لوحة الاحتفاظ. ثم قم بالمعالجة لمدة 60 ثانية عند ضبط سرعة ستة أمتار في الثانية.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات إلى حطام خلايا الحبيبات والخلايا السليمة. ثم قم بتمرير supinate من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون إلى أنبوب معقم للتحكم في عدم وجود خلايا قابلة للحياة. لوحة 0.1 ملليلتر من العينة على MADC. اجار.
قم بتجميد العينات في حمام ثلج جاف بالإيثانول وتخزينها على درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتجميد ومعالجتها في منشأة الرنين المغناطيسي النووي. بعد شهرين ، تحقق من اللوحات للتحقق من عدم وجود وحدات تشكيل مستعمرة. إذا لم يتم العثور على مستخدم للتليف الكيسي، يمكن إخراج العينات من مختبر BSL 3 لمزيد من التحليل في مرفق الرنين المغناطيسي النووي القياسي.
بعد إعادة تعليق العينات إلى الجفاف في 0.7 ملليلتر من المخزن المؤقت NMR ونقلها إلى جهاز طرد مركزي أنبوب طرد مركزي صغير لمدة ثلاث دقائق في 13،000 مرة. G ، قم بإزالة 0.6 مل ونقله إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي بطول خمسة ملليمترات. من تحليل الوسائط ، يسهل الرف المخصص تحميل أنابيب الرنين المغناطيسي النووي المتعددة في المغازل بالعمق الصحيح.
ثم انقل العينات إلى مطياف الرنين المغناطيسي النووي لإدخالها في مبدل عينة 20 من ABA-CS. بالتناوب بين الثقافات غير المعالجة والمعالجة بالمخدرات. يجب تحميل العينة الأولى مسبقا في المغناطيس في بداية التشغيل الآلي.
لمعايرة الأداة ، قم بتحسين طول النبضة 90 درجة بعينة واحدة وضبط الأداة للعينات المتبقية. استخدم أيقونة الرنين المغناطيسي النووي والرقائق التقديرية. أتمتة القفل وجمع بيانات الرنين المغناطيسي النووي لكل عينة.
بالنسبة إلى طيف الرنين النووي المغناطيسي النووي للهيدروجين 1D ، حدد تسلسل النبض مع قمع الماء ونحت الإثارة. قم بتعيين ما مجموعه 32,000 نقطة بيانات و 128 عملية مسح و 16 عملية مسح وهمية لطيف مراقبة الجودة اثنين DH واحد C 13 hs. حدد تسلسل النبض.
حدد ما مجموعه 2048 نقطة بيانات بعرض مسح على طول بعد H المباشر و64 نقطة بيانات بعرض مسح على طول البعد C 13 غير المباشر. حدد أيضا مجموعة الطيف مع 128 مسحا ضوئيا و 16 مسحا وهميا للحصول على إشارة جيدة للضوضاء. ولد طيف من السل ما يقرب من 400 قمة ، بما في ذلك 50 مستقلبا معروفا.
على سبيل المثال ، أنتجت معالجة البيانات كما هو مفصل في المخطوطة المصاحبة هذا الطيف من المستقلبات التي ترتبط بشكل مباشر أو غير مباشر بمسار D alanine. يتناسب حجم شدة الذروة مع تركيزات المستقلب الموجودة في مستخلص الخلية ، لذلك يمكن قياس الاضطرابات النسبية في المستقلبات ومسارات التمثيل الغذائي بين العينات والعلاجات. تمهد التمثيل الغذائي LMR الطريق للأبحاث في مجال علم الجراثيم لاستكشاف علم وظائف الأعضاء والتسبب في البكتيريا البصرية والميكروتيريا الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض أو غير المسببة للأمراض.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مستخلصات خلايا السل المتعددة لتمثيل التمثيل الغذائي بالرنين المغناطيسي النووي ، والأهم من ذلك الحفاظ على الاتساق في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله للحصول على نتائج موثوقة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تركز هذه الدراسة على تحليل الملف الشخصي الأيضي لعصية السل باستخدام علم الأيض النووي المغناطيسي. يتضمن الإجراء زراعة البكتيريا في مزارع مرق وتحضير المستخلصات الخالية من الخلايا للتحليل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأيض
- علم الأحياء الدقيقة
- عصية السل
الخلفية
- عصية السل هي مُمْرِض مهم مسؤول عن مرض السل.
- فهم ملفها الأيضي يمكن أن يوفر رؤى حول فسيولوجيتها.
- علم الأيض النووي المغناطيسي هو أداة قوية لتحليل المستقلبات.
- الاختلافات في ظروف النمو يمكن أن تؤثر على الملفات الأيضية.
هدف الدراسة
- لتحليل الملف الأيضي لعصية السل.
- لتقييم تأثيرات المكملات الغذائية والعلاجات على الأيض.
- لاستخدام التحليل النووي المغناطيسي لتحديد المستقلبات في المستخلصات الخالية من الخلايا.
الطرق المستخدمة
- زراعة عصية السل في مرق.
- حصاد الخلايا في مرحلة نمو مناسبة.
- تفتيت الخلايا للحصول على مستخلصات خالية من الخلايا.
- إعادة تعليق المستخلصات في المخزن المؤقت لتحليلها بالرنين المغناطيسي النووي.
النتائج الرئيسية
- يكشف تحليل الرنين المغناطيسي النووي عن تغييرات في مستويات المستقلبات عند التعرض للعلاجات المختلفة.
- تم تحديد المسارات الأيضية الرئيسية المتأثرة بظروف مختلفة.
- تم التحقق من قابلية تطبيق علم الأيض النووي المغناطيسي في دراسة عصية السل.
- قدم رؤى حول الجوانب الفسيولوجية للعصية.
الاستنتاجات
- علم الأيض النووي المغناطيسي فعال لتحليل عصية السل.
- الاختلافات في ظروف النمو تؤثر بشكل كبير على الملفات الأيضية.
- يمكن لهذا النهج تعزيز فهم أيض السل.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Robust metabolomic profiling of Mycobacterium tuberculosis extracts using NMR enables high-confidence interrogation of metabolic pathways under drug treatment and genetic perturbation. This workflow supports target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage, directly informing lead identification and prioritization for anti-tubercular drug development. Reliable, quantitative metabolite data enhances predictive confidence and translational continuity across the early discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative comparison of metabolic profiles between wild-type and mutant strains under various treatments.
- Supports identification of metabolic pathway perturbations linked to drug action or resistance mechanisms.
- Facilitates functional target validation by correlating gene or protein changes with metabolite shifts.
- Provides mechanistic de-risking by clarifying downstream biological effects of candidate interventions.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible sample preparation for NMR-based metabolite quantification.
- Generates high-quality, quantitative outputs suitable for screening compound effects on bacterial metabolism.
- Enables assay scalability and platform reuse for diverse experimental conditions and compound libraries.
- Supports reliable evaluation of metabolic responses to drug candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic readouts with disease-relevant pathways for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage metabolic insights to preclinical validation of drug effects.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative metabolic perturbations.
- Supports predictive de-risking for candidate selection in tuberculosis drug pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This NMR metabolomics workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven target validation and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantitative metabolite profiling clarifies pathway engagement and biological response to interventions.
- Screening: Standardized sample preparation and NMR analysis enable reproducible, quantitative assay outputs.
- Analytics: High-resolution spectra and statistical analysis facilitate robust comparison of metabolic states across conditions.
- Translational Research: Metabolite data inform biomarker alignment and disease relevance for preclinical models.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable for parallel proteomic analysis and scalable across multiple experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable metabolomics workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-tubercular portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of drug candidates targeting M. tuberculosis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biosafety level 3 handling and NMR metabolomics.
- Demands access to high-field NMR instrumentation and analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to minimize sample variation.
- Adaptable for use with other mycobacterial or microbial systems with protocol modifications.
- Sample consistency and biosafety compliance are critical for reliable, actionable data.
