تجزئة والقياس من وحدات تخزين الدهون في الفئران نماذج السمنة عن طريق الأشعة السينية التصوير المقطعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير وقياس وتصور محتوى الدهون في الفئران الحية بطريقة غير جراحية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء مسح بالأشعة المقطعية (X-ray CT) للفأر. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي تقسيم وقياس أحجام الدهون داخل الفأر بناءً على الكثافة الإشعاعية.

تتمثل الخطوة الثالثة في تصور بيانات CT ثلاثياً مع تظليل أحجام الدهون باللون الأحمر. وفي النهاية، تتيح النتائج قياس وتصور محتوى الدهون خلال الدراسات الطولية الحيوية (in vivo) باستخدام جهاز albia X-ray ct، مقترناً بحزم برمجيات PMOD و vol view. وتكمن إحدى المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التحليل خارج الجسم (X vivo)، في أنها تتيح تقييماً غير جراحي وطولياً للدهون في نماذج أمراض الحيوانات الصغيرة.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن بروتوكول التقسيم والتصوير يتضمن عدة خطوات يجب إكمالها على التوالي. علاوة على ذلك، يجب استخدام معلمات الأشعة السينية المثلى أثناء عملية الاستحواذ. وللحصول على أفضل تباين من الأنسجة الدهنية، ابدأ بتخدير الفئران المصابة بالسمنة المستهدفة باستخدام غرفة تحريض ثم انقلها إلى المخروط الأنفي.

حافظ على التخدير أثناء التصوير، وقم بوضع الفئران في سرير جرذان قياسي مع جعل الأطراف جانبية بالنسبة للجذع. يضمن ذلك الحصول على صور CT موحدة. اضبط نظام CT لمسح سرير بطول 115 millimeters باستخدام 600 projections.

اضبط مصدر الأشعة السينية على 200 microamps و 45 kilovolt peak، واستخدم مرشح ألومنيوم بسماكة 0.5 millimeter لتقسية الشعاع. تبلغ جرعة الإشعاع العميقة المكافئة التي سيتلقاها الفأر وفق هذا الضبط حوالي 220 milli seavers، بينما تبلغ الجرعة السطحية المكافئة 357.4 milli seavert على جهاز الكمبيوتر. اختر خوارزمية FBP باستخدام المعايير القياسية لإعادة بناء الصورة.

في النهاية، تتكون الصورة النهائية من ثقوب متناحية (isotropic) بحجم 125 ميكرون، ويمكن استخدامها لتحليل صور الحيوان بأكمله. يتم إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج تحليل PMOD؛ حيث يقوم PMOD أولاً بتقسيم الصور وفقاً لكثافة الأنسجة، ثم تحديد حجم الدهون. بعد تحميل الصورة، قم بتقليل حجمها لتقليل المتطلبات الحسابية.

انتقل إلى علامة تبويب العرض الرئيسية، واختر الأدوات ثم التخفيض. اضبط قيم التخفيض على اثنين لـ X، واثنين لـ Y، واثنين لـ z، ثم حدد موافق، واستبدل، وشغّل العملية. سيظهر مربع رسالة عند اكتمال العملية.

لإزالة عناصر السرير ومخروط الأنف من الصور، قم بتغطيتها (mask) قبل تحليل منطقة الاهتمام (VOI). انتقل إلى تخطيطات المستويات، والتدويرات، وعلامات المرآة ثلاثية الأبعاد، واختر المستويات والتخطيطات. حدد إظهار المستوى Z، ثم قم بالتمرير وصولاً إلى مخروط الأنف في المستوى Z.

بعد ذلك، حدد علامة تبويب VOI الرئيسية واختر "رسم الرؤوس" (draw vertices). ارسم منطقة اهتمام (ROI) حول الأنف، مع استبعاد السرير ومخروط الأنف، ثم اختر "نسخ منطقة الاهتمام الفعلية إلى الأخرى" (copy actual ROI to each other). قم بإجراء القطع باستخدام عنصر مخروط الأنف.

قم بلصق المنطقة ذات الاهتمام (ROI) من المخزن المؤقت فوق الأنف حسب الحاجة. استخدم أمر تحرير مجموعة الرؤوس لضبط المناطق ذات الاهتمام. وعندما لا تعود مخاريط الأنف مرئية، احذف المنطقة ذات الاهتمام (ROI) وقم بإنشاء حجم اهتمام (VOI) ليشمل محيط الحيوان.

انتقل إلى أدوات VOI، ثم اختر masking و algebra. أدخل القيمة 1000- في مربع الحوار المخصص. ثم اختر الزر الذي يحمل عبارة Mask voxels outside the selected vois.

عندما تظهر رسالة "عملية بيانات غير قابلة للتراجع، هل تريد الاستمرار؟"، اختر "نعم". الآن انتقل إلى تخطيطات المستويات (planes layouts)، والتدويرات (rotations)، وعكس علامات ثلاثية الأبعاد (mirror 3D markers)، وأخيرًا، المستويات والتخطيطات (planes and layouts). اختر "إظهار جميع المستويات" (show all planes).

افحص سلامة منطقة الاهتمام (VOI). عندما تبدو منطقة الاهتمام صحيحة، احفظها كملف تحليل وقم بتغيير بادئة اسم الملف. انتقل بعد ذلك إلى تقسيم الصورة لحساب الحجم الكلي للحيوان.

ابدأ باختيار الأدوات (tools) والخارجيات (external). ثم حدد مربع اختيار التجزئة (segmentation). أدخل نطاقاً من 300- إلى 3,500+ وقم بتشغيل عملية التجزئة.

ثم اختر إحصائيات VOI، والتي تعرض الإحصائيات التي تمثل الحجم الإجمالي. دون ملاحظة هذا الحجم. الآن، قم بتقسيم الصورة لتحديد حجم الدهون عن طريق العودة أولاً إلى الصورة الكتلية غير المقسمة.

ثانياً، قم بتحميل ملف بيانات الكتلة المحفوظ وقم بتفعيل مربع "analyze" (تحليل) في نافذة التحميل. بعد ذلك، اختر "tools" (أدوات) ثم "external" (خارجي). ثم حدد مربع اختيار "segmentation" (تقسيم).

أدخل نطاقاً من 200- إلى 50- ثم قم بتشغيل عملية التجزئة. بعد اعتماد النتائج، اختر VOI.Statistics. يرجى ملاحظة أن الإحصائيات المسجلة تمثل حجم الدهون.

احفظ النتائج بالتنسيق الذي تم تحليله وقم بتحديد بادئة فريدة لاسم الملف. ومع ذلك، إذا ظلت هناك كثافة جلدية أو طرفية، فاستخدم بروتوكول التآكل والتمدد (erosion and dilation) للقضاء على هذه المناطق من أجل تحليل VOI. قبل الحفظ، انتقل إلى tools external وحدد مربع الاختيار morphological في المربع الجديد.

اختر التآكل (erosion) يليه. حسنًا، ارجع إلى مربع اختيار المورفولوجيا واختر التمدد (dilation)، ثم تحقق من حل مشكلة كثافة الجلد أو المحيط، واحفظ النتائج. استخدم حزمة برمجيات Volvo view الإصدار 3.2 لإنشاء عروض مرئية ثلاثية الأبعاد مُصيرة للصور المجزأة.

ابدأ بفتح مجموعة بيانات التصوير المقطعي المحوسب (CT) المحفوظة بتنسيق التحليل. استخدم الإعدادات الافتراضية في النافذة المنبثقة، ثم افتح قائمة المكونات الإضافية (plugins) واختر "دمج الأحجام" (merge volumes) من قائمة الأدوات المساعدة (utility). قم بإلغاء تحديد "إعادة تحجيم المكونات" (rescale components).

انقر على تعيين المدخل الثاني (assign Second input). اختر بيانات الدهون المقسمة للمدخل الثاني واستخدم الإعدادات الافتراضية في النافذة المنبثقة. ثم قم بتطبيق المكون الإضافي للحصول على عرض أكبر للفأر الخاضع للدراسة.

انقر نقراً مزدوجاً على نافذة عرض الحجم. عُد إلى علامة تبويب اللون/الشفافية (color slash opacity). يشير مربع القائمة المنسدلة للمكون إلى مجموعة البيانات التي يتم تحريرها حالياً.

يوجد شريطان منزلقان في أسفل علامة التبويب، حيث يحددان السطوع النسبي لكل مجموعة بيانات مكونة ضمن التراكب باستخدام قيم تتراوح بين صفر وواحد. لتغيير اللون إلى التدرج الرمادي، على سبيل المثال، انتقل إلى قسم تعيين الألوان القياسي.

انقر نقراً مزدوجاً على أحد أشرطة التمرير واسحبه خارج المربع. أضف شريط تمرير ثانٍ بالنقر في أي مكان داخل منطقة أشرطة التمرير. اجعل شريط تمرير اللون الأيسر باللون الأسود وشريط تمرير اللون الأيمن باللون الأبيض.

بعد ذلك، انتقل إلى مربع تعيين الشفافية القياسية (scalar opacity mapping) وأنشئ نقطة جديدة بالنقر داخل المربع. سيؤدي ذلك إلى توفر ثلاث نقاط إجمالاً في النافذة للنقطة الوسطى. قم بتغيير القيمة القياسية إلى حوالي -3000 وتغيير قيمة الشفافية إلى صفر.

توجد النقطة الثالثة على يمين النافذة، قم بتغيير قيمتها القياسية (scalar) إلى حوالي 32,000 ودرجة شفافيتها إلى 0.25. يمكن وضع النقطة الأولى في أي مكان إلى اليسار، شريطة ضبط قيمة الشفافية على صفر. ومع ضبط القيمة القياسية، انتقل إلى المكون الثاني (component two)، والذي من شأنه تعديل مظهر الدهون، وقم بتغيير كل من منزلقات الألوان إلى اللون الأحمر عن طريق النقر المزدوج وتحريك منزلق تدرج اللون H إلى النهاية.

يتم تلوين الدهون باللون الأحمر (ألوان زائفة). لإنشاء فيلم دوران مكون من ثلاث لوحات يعرض الأشعة المقطعية للدهون والتراكب، أولاً قم بالنقر وسحب الماوس لتحريك الجسم إلى وضع قائم بحيث يكون الظهر مواجهاً لـ U. ثانياً، تحت أوزان المكونات (component weights)، اضبط قيمة المكون الثاني على صفر بحيث لا يتم عرض سوى التصوير المقطعي المحوسب (CT scan). ثالثاً، انقر على مراجعة (review) ثم الكاميرا واختَر عدداً من الإطارات لفيلم الدوران. رابعاً، غيّر قيمة دوران محور X إلى 360 درجة.

اختر "create" (إنشاء) للمرة الخامسة في مربع الحوار المنبثق. أنشئ مجلداً جديداً باسم CT واحفظ الملف بتنسيق TIF، والذي سيخرج سلسلة من صور الدوران. كرر هذه الخطوات لصورة الدهون وكذلك لصورة CT المدمجة مع الدهون، مع حفظ صور الدوران الخاصة بكل منها في مجلدات مستقلة لإنشاء فيلم دوران من الصور المخرجة؛ ثم افتح برنامج Image J واستورد تسلسلات الصور.

حدد الصورة الأولى في مجلد CT وسيتم تحديد الصور الأخرى تلقائياً. كرر هذه العملية بالنسبة لتسلسلات الدهون (fat) والتراكب (overlay) باستخدام إحدى المجموعات. لا يزال البرنامج مفتوحاً.

افتح مدير مناطق الاهتمام (ROI manager). يوجد هذا الخيار تحت أدوات التحليل (analyze tools)، ثم مدير مناطق الاهتمام (ROI manager)؛ قم برسم منطقة اهتمام (ROI) حول الفأر الخاضع للدراسة بحيث تستثني بكسلات الخلفية غير الضرورية. عند الانتهاء، انقر على "إضافة" (add) في مدير مناطق الاهتمام.

بعد ذلك، قم بتطبيق منطقة الاهتمام (ROI) نفسها على كل تسلسل صوري. وعندما تصبح منطقة الاهتمام (ROI) مطبقة على جميع المجموعات (stacks)، انقر بزر الماوس الأيمن. ومن داخل خيارات منطقة الاهتمام (ROI)، اختر "duplicate" ثم "select". وتحقق من المجموعة المكررة.

يؤدي ذلك إلى فصل المنطقة ذات الاهتمام (ROI) عن بقية الصورة. الآن، أغلق مجموعات الصور الأكبر وكرر هذا الإجراء لجميع تسلسلات الصور الثلاثة. لدمج المجموعات، استخدم الأمر combine، الموجود تحت قائمة stacks، ثم tools.

اختر مجموعة صور الأشعة المقطعية (CT stack) للمجموعة الأولى، ومجموعة صور الدهون (fat stack) للمجموعة الثانية. ثم كرر العملية، باختيار المجموعات المدمجة حديثاً للمجموعة الأولى ومجموعة التراكب (overlay stack) للمجموعة الثانية.

بهذا تكتمل عملية إنشاء مكدس تدوير صور مكون من ثلاث لوحات. استعرض المكدس من خلال اختيار زر التشغيل في الزاوية السفلية اليسرى من نافذة الصورة، ثم احفظه كفيلم بصيغة AVI.

تم استخدام فئران من سلالة B six V LE OB J المصابة بالسمنة لتوضيح جدوى نظام Alber CT. وبالنسبة لقياسات محتوى الدهون القائمة على التصوير المقطعي المحوسب (CT)، تمت مقارنتها مع فئران من النوع البري C 57 black six. ويظهر على اليسار الحجم الإجمالي للتصوير المقطعي المحوسب لفأر مصاب بالسمنة.

يظهر في المركز حجم الدهون باللون الأحمر، وفي اليمين تظهر الصورة المتراكبة. ويظهر تحليل مماثل للحيوانات من النوع البري فرقاً جوهرياً في محتوى الدهون مقارنة بالفأر المصاب بالسمنة. وقد تم حساب الحجم الإجمالي وحجم الدهون ونسب الأحجام لكل حيوان.

كان متوسط نسبة الدهون إلى الحجم الكلي لمجموعة النوع البري والمجموعة البدينة 0.09 و0.42 على التوالي. وقد اختلفت هذه القيم بشكل ملحوظ بقيمة P تساوي 0.001. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لدى المشاهد فهم راسخ حول كيفية تقسيم أحجام الدهون ضمن مجموعة بيانات التصوير المقطعي المحوسب (CT) لفأر حي بمجرد إتقان هذه العملية.

يستغرق تنفيذ هذه التقنية أقل من 30 دقيقة. شكراً لمشاهدتكم، ونلقاكم في المرة القادمة.