تحديد نشاط السامة للخلايا الأمثل للHer2neu CD8 خلايا تي محددة الإنسان من خلال مقارنة الفحص الإصدار Cr51 إلى نظام xCELLigence

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد نشاط الخلايا التائية السامة للخلايا من خلال مقارنة نهج قائم على المعاوقة باستخدام نظام EXOGEN بمقايسة إطلاق الكروم. يتم تحقيق الخطوة الأولى عن طريق فصل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة عن الدم الكامل باستخدام الموال. بعد ذلك ، تتم إضافة PBMC إلى الآبار جنبا إلى جنب مع مستضد الببتيد ، و IL المؤتلف البشري الثاني ، و PBMC المشع لإنشاء ثماني خلايا تائية خاصة بالمستضد.

ثم يتم زراعة ثماني خلايا تائية خاصة بالمستضد مع الخلايا السرطانية في كلا المقايسين من أجل التسبب في موت الخلايا السرطانية. يتم الحصول على النتائج التي تظهر النسبة المئوية لتحلل الخلايا السرطانية باستخدام كل من طريقة المعاوقة ومقايسة إطلاق الكروم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل مقايسة إطلاق الكروم ، هي أن النظام القائم على المعاوقة يجمع البيانات في الوقت الفعلي ويتطلب عددا أقل من الخلايا التي لا تحتاج إلى أي وضع على هذا البروتوكول ، يوفر الدم من HLA السليم العادي A اثنان من المتبرعين الإيجابيين مصدرا ل pbmc أو خلايا الدم المحيطية أحادية النواة باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

استخدم F call PA plus لفصل P BMCs عن الدم. بعد ذلك ، تقوم ست ألواح بئر بتحميل ما يقرب من 4 ملايين P BMCs في ملليلترين من الوسائط لكل بئر. لكل منهما ، أضف HLAA اثنين من الببتيد الملزم للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام لكل مزرعة مليلتر.

الخلايا في أيام متناوبة للمساعدة في تحفيز الخلايا التائية وتوسيعها. أضف وسائط جديدة مكملة بالمؤتلف البشري IL اثنين للحصول على تركيز نهائي يبلغ 50 وحدة لكل مليلتر. بعد أسبوع واحد ، قم بإعداد مزرعة pbmc ذاتية المنشأ ، وقم بإشعاع الخلايا وخفقها لمدة ساعتين بنفس HLA.

يعيد الببتيد الملزم بمعدل 10 ميكروغرام لكل مليلتر تحفيز الثقافة عن طريق إضافة مليلتر واحد من PBM CS ذاتي المشعع إلى كل منهما. حسنا ، استمر في إضافة وسائط جديدة مكملة ب IL اثنين في أيام متناوبة بعد أسبوع آخر ، وأعد تحفيز الثقافات بنفس الطريقة للمرة الثانية. بعد ستة أيام أخرى في الثقافة ، ستكون الخلايا جاهزة للاستخدام.

تجهيز محطة قياس مقاومة الذكاء للاستخدام عن طريق موازنتها إلى 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة على الأقل. حصاد 75٪ من الخلايا السرطانية البشرية المتجمعة باستخدام 0.25٪ التربسين والطرد المركزي. عد الخلايا السرطانية باستخدام مقياس الخلوي الدموي وأعد تشكيلها في RPMI.

وسائط الورم بتركيز 7 ، 500 خلية لكل ميكرولتر. البرنامج التالي ، يقوم برنامج وكيل Excel بإعداد صفحة التخطيط باستخدام تخطيط البئر. قم بإعداد صفحة الجدول الزمني لأخذ قراءات المعاوقة كل خمس دقائق لمدة 40 ساعة لمدة 18 ساعة الأولى ، وسيأخذ نظام Xceligent قراءات مقاومة للخلايا السرطانية فقط.

ثم أضف 100 ميكرولتر من وسائط الورم RPMI لكل بئر. خذ قراءة خلفية عن EPLs من هناك عن طريق قياس المعاوقة في حالة عدم وجود الخلايا. بعد إضافة الخلايا السرطانية ، قم بتحميل الألواح في المحطة وابدأ في أخذ القراءات.

ستبدأ الخلايا السرطانية على الفور في الالتصاق ب EPLs. بعد حوالي 18 ساعة من الحضانة ، ستكون الخلايا السرطانية قد تلتصق ب EPLs وتتضاعفت إلى 15،000 خلية سرطانية لكل بئر. في هذا الوقت ، تم تحضير الخلايا التائية عن طريق الكشط اللطيف وأجهزة الطرد المركزي التحريض.

الخلايا التائية ، تعيد تشكيلها في وسائط RPMI مع 10٪ FBS وعدها باستخدام مقياس الخلوي الدموي. بمجرد معرفة كثافة الخلايا ، قم بإعداد سلسلة تخفيف مزدوجة من الخلايا التائية بحيث عند إضافة 200 ميكرولتر من الخلايا التائية إلى الخلايا السرطانية ، يكون أعلى تركيز 40 خلية تائية لكل خلية سرطانية. يجب أن يوفر التخفيف الأخير للسلسلة 1.25 خلية تائية لكل خلية سرطانية.

أوقف محطة EXOGEN مؤقتا وقم بإزالة EPL باستخدام ماصة. قم بإزالة الوسائط الموجودة في الآبار ، ثم قم بتحميل 200 ميكرولتر من الخلايا التائية باستخدام جميع التركيزات من سلسلة التخفيف كعنصر تحكم سلبي. استخدم وسائط نقية ، وأعد EPL إلى المحطة من هناك وتابع البرنامج في نهاية الفحص.

تطبيع النتائج. اتبع دائما إجراءات السلامة من الإشعاع المؤسسية عند العمل مع الخلايا المستهدفة المسماة بالكروم 51 والكروم 51 واستخدم التدريع لتقليل التعرض للإشعاع. ابدأ بنبض الخلايا السرطانية لمدة ساعتين بمعدل 1 مليون خلية لكل مليلتر مع 10 ميكرولتر لكل مليلتر من الكروم الطازج 51.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا السرطانية في 10 ملليلتر من وسائط RPMI باستخدام 10٪ FBS الطرد المركزي للخلايا وإعادة تشكيلها في نفس الوسائط بمعدل 1 مليون خلية لكل مليلتر. ثم إلى لوحة سفلية مستديرة 96 جيدا. أضف 100،000 خلية سرطانية لكل بئر لحساب الإطلاق التلقائي.

لا تضيف أي شيء آخر إلى ستة من هذه الآبار إلى ستة آبار أخرى. أضف 100 ميكرولتر Triton X 100 لتجميع الخلايا وبالتالي حساب الحد الأقصى للإطلاق لجميع الآبار المتبقية. أضف الخلايا التائية إلى اللوحة باستخدام سلسلة التخفيف المعدة مسبقا.

الآن احتضان الألواح لمدة خمس ساعات واجمع 50 عينة ميكرولتر من المادة الطافية من كل منها ، وقم بتحميل العينات جيدا على لوحة luma بعد تجفيف الألواح في غطاء المحرك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. قم بقياس التكلفة لكل ألف ظهور باستخدام عداد جاما للخلية التائية و SKBR ثلاثة. تمت زراعة الخلايا السرطانية على لوحات ذكاء X وتم قياس مؤشر الخلية ، وهو انعكاس لمقاومة اللوحة لأن الخلايا التائية لا تتطلب الالتصاق للتكاثر.

تأثيرها على المعاوقة ضئيلا على مدى 40 ساعة من الثقافة. أظهرت الخلايا السرطانية المزروعة بمفردها قياسا متزايدا للمقاومة. ومع ذلك ، فإن إضافة الخلايا التائية في 18 ساعة تعطل هذا الاتجاه.

يتطلب هذا الحدث تطبيع البرامج بعد إضافة الخلايا التائية ويتم التحقيق فيه بشكل أكبر في التجربة التالية. عندما تم زراعة ثلاث خلايا SK BR بشكل مشترك بتركيزات متفاوتة من الخلايا التائية ، كانت التخفيضات في المعاوقة تعتمد بوضوح شديد على جرعة بيانات الخلايا التائية التي تم جمعها كل خمس دقائق على مدى ثلاث تجارب عند علامة 10 ساعات. اتبعت مؤشرات الخلية متعدد الحدود من الدرجة الثانية على نطاق الخلايا التائية ، مما يشير إلى أن محطة Exogen تراقب الموت بوساطة الخلايا التائية المضغوطة ثمانية من SK B ثلاثة أورام في الوقت الفعلي كانخفاض في مؤشر الخلايا لتحديد ما إذا كانت التخفيضات في مقاومة SK BR ثلاثة بواسطة الخلايا التائية خاصة بالمستضد.

تم زراعة ثلاث خلايا SK KBR مع HLA A ، وهما خليتان تائية إيجابيتان خاصة بالإنفلونزا لا تتعرف على HER اثنين جديدين. كان لهذه الخلايا نشاط محللي أقل بكثير لتحديد ما إذا كانت الخليتان التائية الجديدتان تقتلان في جسم مضاد محدد للمستضد إلى الترابط السريع تم دمجها في الثقافات المشتركة. لم يقلل الجسم المضاد من النشاط اللايتي لخليتين تائية جديدة من P 360 9 محددة.

ومع ذلك ، مع الخلايا التائية التي لم يتم تنشيطها على وجه التحديد باستخدام حبات CD Three و CD 28 المضادة ، فإن الجسم المضاد يثبط التحلل لتحديد ما إذا كان القتل يحدث بطريقة تعتمد على HLA من الفئة الأولى. تمت إضافة الجسم المضاد المضاد من الفئة الأولى من HLA أو الجسم المضاد للتحكم في النمط المتماثل إلى الثقافات المشتركة. دعمت النتائج هذه الفرضية بقوة.

تم زراعة الخلايا التائية بعد ذلك مع الخلايا السرطانية الأخرى بنسبة واحد إلى خمسة. تم استخدام خط الخلية الورمية السلبية HLA A BT 20 كعنصر تحكم سلبي. تظهر النتائج أن الطريقة مفيدة للخلايا السرطانية الملتصقة المستهدفة المتعددة.

إضافة الثقافات المشتركة لخليتين تائية جديدة من P 360 9 إلى الخلايا المستهدفة المسماة بالكروم 51 ، متبوعة بتحليل CRA. يبدو أن مقايسة الاستخبارات أكثر حساسية لتحليل الاتساق. تم حساب التباين داخل الفحص على أنه معامل التباين في كل خلية بين واحد إلى 40 وواحد إلى خمسة.

تم قياس هذا أقل من 15٪ عند أدنى نسب الخلايا. ومع ذلك ، كانت النسبة المئوية للسيرة الذاتية مرتفعة أو لا يمكن التنبؤ بها. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص تباين تحلل الخلايا التائية الثلاثية SK BR عن طريق الزراعة المشتركة مع خطوط مختلفة من الخلايا التائية الخاصة ب P 360 9.

تم إنشاء البيانات بفارق 30 يوما. تم إجراء المقايسات في ثلاث نسخ وكانت النتائج متشابهة جدا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد نشاط الخلايا التائية السامة للخلايا باستخدام ثماني خلايا تائية CD خاصة بالمستضد والخلايا السرطانية باستخدام نهج قائم على المقاومة.