تحديد نشاط السامة للخلايا الأمثل للHer2neu CD8 خلايا تي محددة الإنسان من خلال مقارنة الفحص الإصدار Cr51 إلى نظام xCELLigence

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد نشاط الخلايا التائية السامة للخلايا من خلال مقارنة نهج قائم على المعاوقة باستخدام نظام EXOGEN بمقايسة إطلاق الكروم. يتم تحقيق الخطوة الأولى عن طريق فصل الخلايا الوحيدة ذات النواة من الدم المحيطي من الدم الكامل باستخدام fial. بعد ذلك، تُضاف PBMC إلى الآبار جنباً إلى جنب مع المستضد الببتيدي، و IL two المؤتلف البشري، و PBMC المشععة لإنشاء خلايا CD eight التائية النوعية للمستضد.

يتم بعد ذلك استزراع الخلايا التائية CD8 النوعية للمستضد مع الخلايا الورمية في كلا المقايسين من أجل إحداث موت الخلايا الورمية. وتُستخلص النتائج التي توضح النسبة المئوية لتحلل الخلايا الورمية باستخدام كل من طريقة الممانعة ومقايسة تحرر الكروم. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل مقايسة تحرر الكروم، في أن النظام القائم على الممانعة يجمع بيانات في الوقت الفعلي ويتطلب عدداً أقل من الخلايا التي لا تحتاج إلى أي وسم. وفي هذا البروتوكول، يوفر الدم المأخوذ من متبرعين أصحاء طبيعيين إيجابيي HLA A2 مصدراً للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي pbmc، وذلك باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

استخدم F call PA plus لفصل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (P BMCs) من الدم. بعد ذلك، قم بتوزيع ما يقرب من 4 مليون من الخلايا P BMCs في أطباق ذات ستة آبار، بمعدل 2 ملليلتر من الوسط الزرعي في كل بئر. أضف إلى كل بئر ببتيد الربط HLAA two لتحقيق تركيز نهائي قدره 10 µg/mL من المزرعة.

تُعالج الخلايا في أيام متبادلة للمساعدة في تحفيز وتوسيع الخلايا التائية T-cells. يُضاف وسط غذائي جديد مدعم بـ human recombinant IL-2 بتركيز نهائي قدره 50 units/mL. بعد مرور أسبوع، يتم تحضير مستنبت من pbmc ذاتية، ثم تُعرض الخلايا للإشعاع وتُحفز لمدة ساعتين باستخدام الـ hla نفسه.

يتم إعادة تحفيز المزارع بإضافة 1 مل من PBM CS الذاتي المشع إلى كل بئر، مع إضافة ببتيد رابط ثنائي بتركيز 10 micrograms per milliliter. استمر في إضافة وسط غذائي طازج مدعم بـ IL two في أيام متبادلة. بعد مرور أسبوع آخر، أعد تحفيز المزارع بنفس الطريقة للمرة الثانية. وبعد ستة أيام إضافية في المزارع، ستكون الخلايا جاهزة للاستخدام.

قم بتجهيز محطة قياس المعاوقة الذكية للاستخدام عن طريق موازنتها عند 37 °C تحت 5% CO2 لمدة ساعة واحدة على الأقل. قم بحصاد خلايا ورمية بشرية بنسبة تلاقي 75% باستخدام 0.25% trypsin والطرد المركزي. قم بعد الخلايا الورمية باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) وأعد تعليقها في وسط RPMI.

أوساط الورم بتركيز 7,500 خلية لكل µL. بعد ذلك، يقوم برنامج Xceligent بإعداد صفحة المخطط (layout page) لتحديد توزيع الآبار. يتم ضبط صفحة الجدول الزمني لأخذ قراءات المعاوقة كل خمس دقائق لمدة 40 ساعة؛ وخلال أول 18 ساعة، سيقوم نظام Xceligent بأخذ قراءات المعاوقة للخلايا الورمية فقط.

بعد ذلك، أضف 100 µL من وسط RPMI للأورام لكل بئر. قم بإجراء قراءة خلفية على EPLs عن طريق قياس المعاوقة في غياب الخلايا. وبعد إضافة الخلايا الورمية، ضع الأطباق في المحطة وابدأ في أخذ القراءات.

ستبدأ الخلايا الورمية بالالتصاق فوراً بـ EPLs. وبعد حوالي 18 ساعة من الحضن، ستكون الخلايا الورمية قد التصقت بـ EPLs وتضاعف عددها ليصل إلى 15, 000 خلية ورمية لكل بئر. في هذا الوقت، يتم جمع خلايا T المُحضرة عن طريق الكشط اللطيف والطرد المركزي بالرج.

قم بإعادة تعليق الخلايا التائية (T cells) في وسط RPMI مع 10% FBS، ثم قم بعدها باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). وبمجرد معرفة كثافة الخلايا، قم بإعداد سلسلة تخفيفات مضاعفة للخلايا التائية بحيث يكون أعلى تركيز هو 40 خلية تائية لكل خلية ورمية عند إضافة 200 microliters من الخلايا التائية إلى الخلايا الورمية. ويجب أن يوفر التخفيف الأخير في السلسلة 1.25 خلية تائية لكل خلية ورمية.

قم بإيقاف محطة EXOGEN مؤقتاً وأزل الـ EPL باستخدام ماصة. قم بإزالة الوسط من الآبار، ثم أضف 200 microliters من الخلايا التائية (T cells) باستخدام جميع التركيزات من سلسلة التخفيف كعينة ضابطة سالبة. استخدم وسطاً نقياً، وأعد الـ EPL إلى المحطة وواصل البرنامج عند نهاية المقايسة.

قم بتطبيع النتائج. اتبع دائمًا إجراءات السلامة الإشعاعية المؤسسية عند العمل مع chromium 51 والخلايا المستهدفة الموصومة بـ chromium 51، واستخدم الدروع الواقية لتقليل التعرض للإشعاع. ابدأ بنبض الخلايا الورمية لمدة ساعتين بكثافة 1 million cells per milliliter مع إضافة 10 µL per milliliter من chromium 51 الطازج.

بعد ذلك، اغسل الخلايا الورمية في 10 milliliters من وسط RPMI المحتوي على 10%FBS، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً وأعد تعليقها في الوسط نفسه بتركيز 1 million cells per milliliter. ثم في طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً، أضف 100,000 خلية ورمية لكل بئر لحساب التحرر التلقائي.

لا تضف أي شيء آخر إلى ست من هذه الآبار، وكذلك إلى ست آبار أخرى. أضف 100 µL من Triton X 100 إلى جميع الآبار المتبقية لتحليل الخلايا، وبالتالي حساب الحد الأقصى للتحرر. أضف الخلايا التائية (T-cells) إلى الطبق باستخدام سلسلة التخفيف التي تم تحضيرها مسبقاً.

الآن، قم بحضن الأطباق لمدة خمس ساعات واجمع عينات بحجم 50 µL من السائل الطافي من كل بئر، ثم قم بتحميل العينات على طبق luma بعد تجفيف الأطباق في غطاء التدفق الصفائحي طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. قم بقياس CPM الخاص بها باستخدام عداد غاما. تم استزراع خلايا T-cell وخلايا سرطان SKBR3 على أطباق X intelligence وقياس المؤشر الخلوي، والذي يعد انعكاساً لمقاومة الطبق لأن خلايا T لا تتطلب الالتصاق من أجل التكاثر.

كان تأثيرها على الممانعة ضئيلاً على مدار 40 ساعة من الزرع. وأظهرت الخلايا السرطانية المزروعة بمفردها زيادة في قياس الممانعة. ومع ذلك، فإن إضافة الخلايا التائية عند 18 ساعة تؤدي إلى تعطيل هذا الاتجاه.

يتطلب هذا الحدث تسوية برمجية بعد إضافة الخلايا التائية (T cells)، ويتم استقصاؤه بشكل أكبر في التجربة التالية. عندما تمت زراعة خلايا SK BR three مشتركاً مع تركيزات متفاوتة من الخلايا التائية، كان انخفاض الممانعة معتمداً بشكل واضح جداً على جرعة الخلايا التائية؛ حيث جُمعت البيانات كل خمس دقائق عبر ثلاث تجارب عند علامة الـ 10 ساعات. اتبعت مؤشرات الخلايا حدودية من الدرجة الثانية عبر نطاق الخلايا التائية، مما يشير إلى أن محطة Exogen تراقب موت أورام SK B three بوساطة خلايا CD eight التائية في الوقت الفعلي كـانخفاض في مؤشر الخلايا، وذلك لتحديد ما إذا كانت انخفاضات الممانعة في SK BR three بفعل الخلايا التائية كانت محددة للمستضد.

تمت زراعة خلايا SK KBR 3 بشكل مشترك مع خلايا T نوع FLU موجبة لـ HLA A 2 والتي لا تتعرف على HER 2 neu. أظهرت هذه الخلايا نشاطاً تحللياً أقل بكثير؛ ولتحديد ما إذا كانت خلايا T النوعية لـ HER 2 neu تقوم بالقتل بطريقة نوعية للمستضد، تم دمج أجسام مضادة لـ Fas ligand في المزارع المشتركة. ولم تؤدِ هذه الأجسام المضادة إلى تقليل النشاط التحللي لخلايا T النوعية لـ HER 2 neu P 360 9.

ومع ذلك، في حالة الخلايا التائية (T cells) التي تم تنشيطها بشكل غير محدد باستخدام حبيبات anti CD three وCD 28، ثبّط الجسم المضاد عملية التحلل، وذلك لتحديد ما إذا كانت عملية القتل تحدث بطريقة تعتمد على HLA class one. حيث تمت إضافة إما الجسم المضاد anti HLA class one أو الجسم المضاد الضابط من النوع المتماثل (isotype control antibody) إلى المزارع المشتركة. وقد دعمت النتائج هذه الفرضية بقوة.

بعد ذلك، تمت زراعة الخلايا التائية (T cells) مع خلايا سرطانية أخرى بنسبة واحد إلى خمسة. واستُخدم خط الخلايا الورمية BT 20 السلبي لـ HLA A two كضابط سلبي. وتظهر النتائج أن هذه الطريقة مفيدة للعديد من الخلايا الورمية الملتصقة المستهدفة.

أُضيفت المزارع المشتركة من خليتين تائيين جديدتين من نوع P 360 9 النوعي لـ HER إلى خلايا مستهدفة مُعلمة بالكروميوم 51، تلا ذلك إجراء تحليل CRA. يبدو أن المقايسة الذكية أكثر حساسية لتحليل الاتساق. وحُسب التباين داخل المقايسة كنسبة مئوية لمعامل الاختلاف عند كل نسبة خلوية تتراوح بين 1:40 و1:5.

وقد قِيست هذه القيمة بأقل من 15% عند أدنى نسب للخلايا. ومع ذلك، كان معامل الاختلاف (CV) مرتفعاً أو غير قابل للتنبؤ. بالإضافة إلى ذلك، تم فحص تباين تحلل خلايا SK BR three T-cell عن طريق الزراعة المشتركة مع خطوط خلايا T مختلفة متخصصة في P 360 9.

تم توليد البيانات بفاصل زمني قدره 30 يوماً. وقد أُجريت المقايسات في ثلاث مكررات وكانت النتائج متشابهة جداً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد نشاط الخلايا التائية السامة للخلايا باستخدام الخلايا التائية CD eight النوعية للمستضد والخلايا الورمية، وذلك من خلال نهج يعتمد على الممانعة.