كشف إزفاء السمية في العصارة الخلوية المضيف بواسطة الرنين مأكل السطح

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن مجمع السموم الذي يدخل إلى العصارة الخلوية وتقديره كمياً. ولتحقيق ذلك، يتم أولاً ربط السموم بسطح الخلية المضيفة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يتم إزالة السموم غير المرتبطة وتدفئة الخلايا إلى 37 °C، مما يسمح بانتقال السموم إلى نظام الغشاء الداخلي، ومن ثم إلى العصارة الخلوية للمضيف؛ ثم يُستخدم digitonin لنفاذية الغشاء البلازمي بشكل انتقائي بعد نفاذية الخلايا.

يتم تقسيم مستخلصات الخلايا إلى أجزاء منفصلة من الغشاء والسيتوسول باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، وكخطوة نهائية، يُستخدم رنين البلازمون السطحي (SPR) للكشف عن دخول السموم إلى السيتوسول وتقدير كميتها، وذلك عن طريق تروية جزء السيتوسول فوق مستشعر SPR مطلي بجسم مضاد للسم. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا السموم، مثل كفاءة وحركية دخول السموم إلى السيتوسول، وكمية السم التي تدخل السيتوسول، والتثبيط الدوائي المحتمل لانتقال السموم إلى السيتوسول. قبل البدء في هذا البروتوكول، قم بتحضير خلايا HeLa للتسمم الخلوي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب بعد حضانة خلايا HeLa طوال الليل.

استبدل وسط الزرع بـ 1 mL من DMEM الذي يحتوي على 100 ng/mL من Ganglioside GM1 واتركه في الحاضنة لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. يؤدي ذلك إلى زيادة عدد مواقع الارتباط لسم الكوليرا، حيث سيتداخل مستقبل GM1 الخاص بالسمات في الغشاء البلازمي للخلايا المعرضة لمحلول GM1.

بعد فترة حضانة لمدة ساعة واحدة، قم بإزالة وسط GM one واغسل الخلايا مرتين باستخدام DMEM. ثم أضف واحد ملي لتر من DMEM الذي يحتوي على واحد ميكروغرام لكل ملي لتر من سم الكوليرا، وضع الخلايا عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على السم واغسل الخلايا مرتين.

بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا في 1 مل من DMEM عند 37 درجة مئوية للمدة الزمنية المطلوبة. وفي نهاية كل فترة مطاردة، تُغسل الخلايا باستخدام PBS، ثم يُحضن كل بئر مع 250 µL من EDTA بتركيز 0.5 mM وPBS. وبعد تحضين لمدة 10 دقائق على الجليد، تُزال الخلايا من طبق الستة آبار عن طريق السحب الشديد (TRI) باستخدام ماصة P 1000.

بعد جمع الخلايا من البئر الأولى، ادمجها مع الخلايا من البئر الثانية ثم الثالثة من نفس الحالة التجريبية. بعد ذلك، ضع معلق الخلايا المدمج من الآبار المكررة الثلاثة في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد. الآن، قم بتدوير أنبوب الطرد المركزي الدقيق في جهاز طرد مركزي دقيق مكتبي لمدة خمس دقائق.

عند 5,000 ×g، يجب الحصول على كرات خلوية متساوية الحجم تقريبًا لجميع الظروف. تخلص من الطافي ثم أعد تعليق الكرة الخلوية في 100 µL من محلول عمل بتركيز 0.04% من digitonin تم تحضيره مسبقًا وتبريده. ضع معلق الخلايا على الثلج لمدة 10 دقائق، وباستخدام جهاز طرد مركزي صغير (micro centrifuge)، قم بتدوير الخلايا المنفذة بالـ digitonin عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق.

انقل الجزء العلوي (الرائق) الذي يحتوي على السيتوسول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد، واحتفظ بالجزء الراسب الذي يحتوي على العضيات. يتم تحضير معايير سم SPR بتركيزات 110 و 1 و 0.1 nanograms per milliliter في محلول HCN المنظم، بينما يتم تحضير العينات عن طريق تخفيف أجزاء الرائق التي تحتوي على السيتوسول في محلول HCN المنظم وصولاً إلى حجم نهائي قدره 1 milliliter. يجب أن تكون أحجام العينات 1 milliliter على الأقل لضمان تفريغ الهواء من حلقة العينة التي تبلغ سعتها 500 µL قبل الحقن، أما أجزاء الراسب التي تحتوي على العضيات فيعاد تعليقها في 1 milliliter من محلول HCN المنظم المحتوي على 1% Triton X 100.

يعدت إضافة المنظف ضرورية لتحرير مجمع السموم المحاط بالغشاء. قم أيضاً بتحضير مجموعات موازية من الكسور السيتوبلازمية وكسور العضيات لتجربة ضابطة للتأكد من دقة إجراء الفصل التجزيئي، وأعد تعليق الكسر السيتوبلازمي في 20 µL من منظم العينات بتركيز four x، والكسر العضوي في 120 µL من منظم العينات بتركيز one x، ثم قم بفصل أحجام متكافئة من كل كسر باستخدام الفصل الكهربائي للهلام بـ sodium ESAL sulfate والبولياكريلاميد، ثم قم بالتحليل باستخدام لطخة ويسترن لإثبات توزيع بروتين سيتوبلازمي في الكسر الرائق وبروتين ER قابل للذوبان في كسر الراسب. لتحضير شريحة SPR، قم أولاً بتثبيت شريحة زجاجية مطلية بالذهب تحتوي على طبقة أحادية ذاتية التجمع في جهاز SPR.

قم بتنشيط شريحة المستشعر عن طريق تمرير محلول E-D-C-N-H-S فوق الشريحة لمدة 10 دقائق بمعدل تدفق 41 µL/min. نستخدم معدل التدفق نفسه في جميع عمليات التمرير اللاحقة. قم بإزالة محلول تنشيط E-D-C-N-H-S عن طريق غسل اللوح لمدة خمس دقائق باستخدام PBS يحتوي على 0.05% 2020.

تحتوي الشريحة الآن على روابط MI تفاعلية نتيجة إزالة الغطاء بواسطة محلول E-D-C-N-H-S. بعد ذلك، يتم تمرير جسم مضاد لـ CTA فوق شريحة الاستشعار المنشطة بتخفيف قدره واحد إلى 20,000 في خلات الصوديوم بتركيز 20 millimolar لمدة 15 دقيقة. سيُلاحظ انخفاض أولي في وحدة معامل الانكسار، والمشار إليها اختصارًا بـ RIU، وذلك بسبب التغير في pH.

سيتبع ذلك زيادة في وحدات معامل الانكسار (RIU) مع التقاط الأجسام المضادة بواسطة الروابط التفاعلية للأميد. وفيما يخص شريحة المستشعر، قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة من الشريحة عن طريق الغسل بمحلول PBST لمدة خمس دقائق. ستصل إشارة RIU الناتجة عن الأجسام المضادة الملتقطة إلى مرحلة الثبات والاستقرار، مما يوفر إشارة خط أساس جديدة.

كخطوة نهائية في تحضير الشريحة، قم بضخ ethanolamine بتركيز one molar فوق شريحة المستشعر لمدة خمس دقائق. تعمل هذه العملية على تغطية وتعطيل أي روابط غير مرتبطة متبقية على شريحة المستشعر. ستزداد إشارة RIU لإنشاء قراءة خط الأساس، ثم قم بضخ PBST فوق المستشعر المغطى بالأجسام المضادة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، يتم تمرير عينة تجريبية أو معيار سمّ فوق المستشعر لمدة 300 ثانية. يتم إزالة الربيطة من المنظم وتمرير PBST فوق المستشعر لمدة 200 ثانية أخرى. ثم تُزال أي سموم متبقية مرتبطة بالمستشعر عن طريق غسلة ثانية باستخدام PBST عند pH 5.0.

سيؤدي ذلك إلى إعادة الإشارة إلى قراءتها المرجعية الأولية، مما يسمح بمعالجة عينة أخرى على المستشعر نفسه. قبل تحميل عينة جديدة، ادفع كمية صغيرة من الهواء عبر حلقة العينة لطرد أي سائل متبقٍ من العينة السابقة. بعد عملية الاستحواذ.

يمكن تحليل البيانات باستخدام برنامج scrubber two، كما يمكن استخدام برنامج Igor لإعداد الأشكال التوضيحية. ذيفان السعال الديكي هو ذيفان من نوع AB ينتقل من سطح الخلية إلى الشبكة الإندوبلازمية قبل أن تدخل السلسلة α الخاصة به إلى العصارة الخلوية.

يمكن لمقايسة الانتقال القائمة على رنين البلازمون السطحي (SPR) الكشف عن البروتينات السمية (PTs) في سيتوسول خلايا CHO المتسممة. ولم يتم توليد أي إشارة من سيتوسول الخلايا غير المتسممة، مما أكد أن الأجسام المضيلة لـ PTs لا تتفاعل تبادلياً مع أي مكون من مكونات سيتوسول المضيف.

لم يُنتج جزء السيتوسول من الخلايا المسمومة في وجود felden إشارة إيجابية أيضاً؛ حيث يمنع BFA نقل السموم إلى موقع الانتقال في الشبكة الإندوبلازمية، وبالتالي يمنع وصول السلسلة H إلى السيتوسول. ويعد Chole toin سمّاً آخر من النوع AB ينتقل عبر الشبكة الإندوبلازمية.

تم الكشف عن CTA one في الجزء السيتوزولي من خلايا helo المعالجة بـ CT. وقد أكد ذلك أن هذه المنهجية تعمل مع أنواع متعددة من الخلايا ويمكن تطبيقها على أي سم يتوفر له جسم مضاد للسلسلة. لم يتم الكشف عن أي إشارة عند تمرير الجزء السيتوزولي من الخلايا المعالجة بـ CT فوق مستشعر SPR مغطى بجسم مضاد لـ CTB، مما يثبت أن خماسي CTB الرابط للخلية لا يدخل إلى السيتوزول، على عكس الوحدة الفرعية CT A one.

بعد عملية التدفق فوق مستشعر SPR مغطى بجسم مضاد لـ CTA. تظهر الإشارة الناتجة عن جزء العضيات خارج نطاق القياس مقارنة بالإشارة الأضعف الناتجة عن جزء السيتوسول. وهذا يتفق مع عدم الكفاءة المعروفة لنقل CT إلى موقع النقل في الشبكة الإندوبلازمية (ER)، مما يحد بدوره من كمية السم التي يمكن أن تصل إلى السيتوسول.

يمكن أيضاً مراقبة تراكم السم السيتوبلازمي المنقول كدالة في الزمن. فبعد تعريض الخلايا لـ CT عند درجة حرارة 4 °C، لم يتم الكشف عن أي سم في السيتوبلازم بعد 15 دقيقة من التسخين إلى 37 °C.

تم رصد كمية قليلة من السم في العصارة الخلوية بعد 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ورُصدت كميات أكبر تدريجياً من السم في العصارة الخلوية بعد فترات تتبع مدتها 45 و60 دقيقة. يثبت هذا استمرار توصيل السم المرتبط بالخلية إلى العصارة الخلوية المضيفة على المدى الطويل. يمكن للمقايسة أيضاً رصد تثبيط انتقال السم إلى العصارة الخلوية؛ حيث أظهرت الخلايا المعالجة بـ 10%DMSO مستويات منخفضة من CT1 الشبيه بالعصارة الخلوية مقارنة بالخلايا الضابطة المسمومة غير المعالجة التي حدث فيها تفكك لبنية السم.

تُعد السلسلة شرطاً مسبقاً للانتقال إلى العصارة الخلوية (cytosol)، وبناءً على ذلك، فإن تثبيت CT A1 الناتج عن DMSO قد منع انتقاله من الشبكة الإندوبلازمية (ER) إلى العصارة الخلوية. ولتقدير كمية حصر انتقال السم الناتج عن DMSO، استُخدم منحنى قياسي تم إنشاؤه من تركيزات معروفة من السم لحساب تركيز CT A1 في العصارة الخلوية، والذي بلغ 0.3 nanograms per milliliter للخلايا غير المعالجة، و0.1 nanograms per milliliter للخلايا المعالجة بـ DMSO. وبذلك، أدى تثبيط عملية تفكك CT A1 بواسطة DMSO إلى انخفاض بمقدار ثلاثة أضعاف في عملية الانتقال من الشبكة الإندوبلازمية إلى العصارة الخلوية لـ CT A1.

بعد اتباع هذا الإجراء، سنتمكن من استخدام تقنيات أخرى مثل مقايسات التسمم لإيجاد صلة مباشرة بين كمية السم الموجودة في السيتوسول ونشاط السم.