موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)

الهدف العام من التجربة التالية هو دمج بنية DNA مرغوبة في الكروموسوم البكتيري عند موقع محدد مسبقاً. ويتم تحقيق ذلك من خلال بروتوكول تزاوج يتضمن أربع سلالات بكتيرية معدلة وراثياً. تحتوي السلالة المستقبلة على تسلسل "منصة هبوط" (landing pad) يتكون من جين مقاومة spec mycin وجين e coli beta glucuronidase، يحيط بهما مواقع ATP مدمجة في الكروموسوم الخاص بها.

تحمل سلالة المانح P JH one 10 بلازميداً يحتوي على موقعي B يحيطان بجين بروتين فلوري أحمر حاشية، وجيناً لمقاومة المضادات الحيوية. بينما تحمل سلالة المانح PJC two بلازميداً يحتوي على إنزيم integrase النوعي للموقع من عاثية streptomyces C 31 تحت تحكم محفز LAC. وتوفر السلالة الرابعة MT 616 جينات النقل اللازمة لعملية الاقتران، وهو نقل البلازميدات من خلية إلى أخرى، مما يؤدي إلى تكوين سلالات متحولة عبر السلالات المستقبلة.

الحصول على البلازميدين اللازمين لعملية تبادل الكاسيت بوساطة الإنتيجريز. يؤدي تبادل كاسيت المانح من بلازميد PJ H one 10 مع علامات كاسيت منصة الهبوط على الكروموسوم إلى فقدان علامات منصة الهبوط، SPR و UIDA، والحفاظ على كاسيت المانح RFP و GMR في الناتج النهائي لعملية النقل. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى مثل إعادة الاندماج المتماثل في سهولة البروتوكول وكفاءته.

كما أنها قابلة للنقل إلى مجموعة متنوعة من البكتيريا. سلالة المستقبل المستخدمة في هذا الفيديو هي سلالة S milli latte. قبل يومين من إجراء التزاوج لإنشاء trans integrins، يتم التلقيح من مستعمرة واحدة في 5 mL من وسط TY الذي يحتوي على spect mycin، ثم تُحضن سلالة S milli عند 30 °C لمدة يومين مع الرج. في اليوم الذي يسبق إجراء التزاوج، يتم تلقيح كل من سلالات e coli التالية في 5 mL من وسط LB السائل المضاف إليه المضاد الحيوي المناسب: سلالة DH five alpha التي تحتوي على بلازميد التعبير عن integrase في وسط يحتوي على tetracycline، وسلالة MT 616 المنشطة (mobilizer) في وسط يحتوي على chloramphenicol، وسلالة DH five alpha التي تحتوي على بلازميد donor cassette في وسط يحتوي على Gentamycin. تُحضن سلالات e Coli الثلاث طوال الليل عند 37 °C مع الرج المستمر. ولتحضير الخلايا لإجراء التزاوج، يتم نقل 1.5 mL من كل من المزارع الأربع إلى أنبوب، ثم تُفصل بجهاز الطرد المركزي عند 17,000 ×g لمدة 30 ثانية لجمع كتلة الخلايا، ثم يُتخلص من الوسط ويُعاد تعليق كل كتلة خلوية في 1 mL من محلول sodium chloride عقم بنسبة 0.85%. تُفصل الأنابيب مرة أخرى بجهاز الطرد المركزي، وبعد التخلص من السائل الطافي، يُعاد تعليق كل كتلة في 100 µL من محلول sodium chloride عقم بنسبة 0.85%. وباستخدام الماصة، يتم وضع 10 µL من المزرعة المغسولة لكل سلالة بشكل فردي على طبق TY agar سادة.

تعتبر هذه البقاع بمثابة بقع تحكم. بعد ذلك، أضف 40 µL من كل سلالة، باستثناء سلالة e coli DH five alpha التي تحتوي على Pjc two، في أنبوب معقم وقم بالمزج عن طريق السحب والتدفق بالماصة، ثم ضع 120 µL من هذا المزيج على طبق TY agar السادة. تمثل هذه البقعة التحكم السلبي الخالي من الإنتيجريز (no integrase negative control).

أخيراً، أضف 40 µL من كل سلالة من السلالات الأربع في أنبوب خلط معقم ثم قم بالتنقيط. ضع 160 µL من هذا الخليط على نفس طبق آجار TDY. هذه النقطة هي نقطة تزاوج تبادل الكاسيت بوساطة الإنتيغريز (integrase mediated cassette exchange mating spot).

ضع الطبق في غطاء تدفق صفائحي واترك البقع لتجف لمدة 20 دقيقة تقريباً بعد ذلك. أغلق الطبق بإحكام واحضنه عند 30 درجة مئوية طوال الليل في اليوم التالي لتخطيط بروتوكول التزاوج. قم بتخطيط بقعتي التحكم وبقعة تزاوج IMCE على أطباق آغار TY المضاف إليها streptomycin و gentamycin.

تحمل سلالة المستقبل S milli طفرة تمنحها مقاومة عالية للستريبتومايسين لحساب كفاءة الـ IMCE. قم بتعليق حوالي ربع بقعة تزاوج الـ IMCE في 500 µL من كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.85%، ثم قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف حتى تصل إلى 10⁻⁷. ازرع التخفيفات من 10⁻² إلى 10⁻⁵ على أطباق أغار TY مدعمة بالستريبتومايسين والجنتاميسين وxgl لاختيار المهاجرين العابرين (trans immigrants). ازرع التخفيفات من 10⁻³ إلى 10⁻⁷ على أطباق أغار TY مدعمة بالستريبتومايسين وxgl لاختيار كل من المهاجرين العابرين والمستقبلين المحتملين (IE total recipients). حضن الأطباق عند 30 °C لمدة ثلاثة أيام.

افحص RFP trans تحت الضوء الأخضر ومن خلال مرشح أحمر، ثم احسب النسبة المئوية لكفاءة IMCE كـ CFU للمهاجرين trans مقارنة بـ CFU لجميع المستقبلين؛ حيث سيكون نصف trans تقريبًا قد خضع لتبادل حقيقي مما يجعلها بيضاء وغير حساسة بعد ثلاثة أيام من الحضن على Ty المكمل بـ streptomycin و Gentamycin. يجب ألا يكون هناك نمو في السلالات الضابطة التالية: no integrase control s milli latte UW 2 27 control e coli MT 616 control e coli DH five alpha containing P JH one 10 control و e coli DH five alpha containing PJC two control. وفي المقابل، يجب أن يُظهر تخطيط IMCE من بقعة التزاوج نموًا متلاحمًا في التخطيط الرأسي والعديد من المستعمرات في التخطيط الثاني. تعرض الصورتان التاليتان تعليقات لإعادة التنشيط لتخفيف 10⁻² من بقعة التزاوج على agar TY streptomycin xgl، وعلى agar TY streptomycin Gentamycin xgl؛ وفي agar TY streptomycin Gentamycin xgl.

تمثل المستعمرات الزرقاء مركبات إعادة تركيب مفردة. بينما تمثل المستعمرات البيضاء إنترجينات منقولة (trans integrins) خضعت لتبادل حقيقي للنقاص (cassette exchange) عند فحصها تحت الضوء الأخضر ومن خلال مرشح أحمر، بينما يفتقر التخفيف بنسبة 2- للمحيط الموضعي لمعلق إعادة تعليق التزاوج على أغار TY strept cin xgl إلى الفلورية. وفي المقابل، يظهر التخفيف بنسبة 10⁻² للمحيط الموضعي لمعلق إعادة تعليق التزاوج على أغار Ty streptomycin Gentamycin Xgl مستويين من الفلورية.

تتوافق المستعمرات الأكثر سطوعاً مع المستعمرات الزرقاء وتظهر تعبيراً أعلى لـ RFP، ويفترض أن يكون ذلك بسبب القراءة النافذة (read through) من محفز LAC في الناقل. أما المستعمرات الأقل سطوعاً فتتوافق مع المستعمرات البيضاء، التي خضعت لتبادل فعلي للكاسيت وتحتوي على RFP مع محفزه المباشر فقط ودون أي قراءة نافذة من محفز LAC. ومن المفترض أيضاً أن تكون هذه الاتجاهات حساسة للـ specks mycin.

يجب أن تتراوح كفاءة دمج الانتقال، والتي يتم التعبير عنها كنسبة مئوية للمهاجرين عبر الانتقال إلى إجمالي المستلمين، في حدود 0.5% بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية استخدام الاقتران البكتيري باستخدام سلالاتنا المهندسة لإدراج بنى DNA في الكروموسوم البكتيري.