موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)

ووصف طريقة سريعة وفعالة لدمج الحمض النووي الأجنبية ذات الاهتمام إلى سلالات متقبل مسبقة الصنع، ووصف سلالات مهبط،. أسلوب يسمح للموقع المحدد التكامل من شريط الحمض النووي في مكان الهبوط وسادة هندسيا من سلالة معينة، من خلال تصريف الافعال والتعبير عن integrase ΦC31.

الهدف العام من التجربة التالية هو دمج بنية الحمض النووي المطلوبة في الكروموسوم البكتيري في موضع محدد مسبقا. يتم تحقيق ذلك من خلال بروتوكول التزاوج الذي يتضمن أربع سلالات بكتيرية هندسية. تحتوي السلالة المتلقية على تسلسل وسادة هبوط يتكون من جين مقاومة الميسين المواصفات وجين e coli beta glucuronidase المحاط بمواقع ATP المدمجة في كروموسومها.

تحمل سلالة P JH one 10 المانحة بلازميد يحتوي على مواقع B يحيط بجين بروتين فلورسنت أحمر ، وجين مقاومة للمضادات الحيوية. تحمل السلالة المانحة PJC اثنين بلازميد يحتوي على إنتگراز خاص بالموقع من عاثية Streptomyces C 31 تحت سيطرة مروج LAC. توفر السلالة الرابعة MT 616 جينات النقل المطلوبة للاقتران ، ونقل البلازميدات من خلية إلى أخرى ، مما يؤدي إلى تكوين عبر السلالات المتلقية.

الحصول على البلازميدين اللازمين لتبادل الكاسيت بوساطة الإنتجاراز. يؤدي تبادل الكاسيت المتبرع من PJ H one 10 البلازميد مع علامات كاسيت منصة الهبوط على الكروموسوم إلى فقدان علامات منصة الهبوط ، SPR و UIDA وصيانة كاسيت المتبرع RFP و GMR في المهاجر العابر الناتج. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى مثل إعادة التركيب المتماثل هي سهولة وكفاءة البروتوكول.

كما أنه قابل للانتقال إلى مجموعة متنوعة من البكتيريا. سلالة المتقبل المستخدمة في هذا الفيديو هي سلالة S milli latte قبل يومين من إجراء التزاوج لإنشاء الإنتجرينات العابرة التي يتم تلقيحها من مستعمرة واحدة إلى خمسة ملليلتر من وسائط TY مع spect mycin تحتضن سلالة S milli عند 30 درجة مئوية لمدة يومين مع الاهتزاز في اليوم السابق لإجراء التزاوج تلقيح كل من سلالات الإشريكية القولونية التالية في خمسة ملليلتر من الوسائط السائلة LB المكملة مع المضاد الحيوي المناسب DH Five alpha الذي يحتوي على البلازميد تعبير Integrase في الوسائط مع التتراسيكلين MT 616 ، فإن الوسائط الداخلية المحفزة مع الكلورامفينيكول و DH Five alpha التي تحتوي على بلازميد كاسيت المتبرع في الوسائط مع Gentamycin تحتضن سلالات القولونية الإلكترونية الثلاثة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر لإعداد الخلايا لإجراء التزاوج. انقل 1.5 مل من كل من الثقافات الأربع إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 17 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية لجمع حبيبات الخلية ، وتخلص من الوسائط وأعد تعليق كل حبيبات خلية في مليلتر واحد من جهاز الطرد المركزي المعقم لكلوريد الصوديوم 0.85٪ ، قم بتعليق كل حبيبات في 100 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم 0.85٪ باستخدام ماصة على حدة 10 ميكرولتر من المزرعة المغسولة لكل منها يصفى على لوحة أجار TY عادية.

هذه البقع هي نقاط تحكم. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من كل سلالة ، باستثناء الإشريكية القولونية DH خمسة ألفا التي تحتوي على Pjc اثنين في أنبوب معقم وخلطها عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 120 ميكرولتر من هذا الخليط على لوحة أجار TY العادية. هذه البقعة هي التحكم السلبي بدون تكامل.

أخيرا ، أضف 40 ميكرولترا من كل من السلالات الأربع في مزيج أنبوب معقم وبقعة. 160 ميكرولتر من هذا الخليط على نفس لوحة أجار TDY. هذه البقعة هي بقعة التزاوج لتبادل الكاسيت بوساطة التكامل

ضع الطبق في غطاء تدفق رقائقي واترك البقع تجف لمدة 20 دقيقة بعد ذلك. أغلق اللوحة واحتضنها عند 30 درجة مئوية طوال الليل في اليوم التالي لخط بروتوكول التزاوج. نقطتا التحكم وبقعة التزاوج IMCE على ألواح أجار TY مكملة بالستربتومايسين والجنتامايسين.

تحمل سلالة المستقبل S milli طفرة تمنح مقاومة عالية المستوى للستربتومايسين لحساب كفاءة IMCE Resus يعلق ما يقرب من ربع بقعة تزاوج IMCE في 500 ميكرولتر من 0.85٪ معقمة كلوريد الصوديوم تجعل التخفيفات التسلسلية عشرة أضعاف إلى 10 إلى اللوحة السابعة السلبية تميل التخفيفات إلى سالب اثنين إلى 10 إلى سالب خمسة على ألواح أجار TY المكملة بالستربتومايسين ، gentamycin و XGL لاختيار المهاجرين المتحولين جنسيا. تميل تخفيفات الألواح إلى سالب ثلاثة إلى 10 إلى سالب سبعة على لوحات أجار TY ، مكملة بالستربتومايسين و xgl للاختيار لكل من المهاجرين المتحولين جنسيا والمتلقين المحتملين. يحتضن إجمالي المستلمين IE الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

عرض RFP trans تحت الضوء الأخضر ومن خلال مرشح أحمر احسب النسبة المئوية لكفاءة IMCE مثل CFU للمهاجرين المتحولين مقارنة ب CFU لإجمالي المستلمين ، سيخضع ما يقرب من نصف المتحولين جنسيا لتبادل حقيقي مما يجعلهم أبيض وغير حساسين بعد ثلاثة أيام من الحضانة على Ty المكملة بالستربتومايسين والجنتاميسين ، يجب ألا يكون هناك نمو في سلالات التحكم التالية ، لا يوجد تحكم متكامل s ملي لاتيه UW 2 27 التحكم e قولونية MT 616 التحكم e القولونية DH خمسة ألفا تحتوي على P JH واحد 10 التحكم و e قولونية DH خمسة ألفا تحتوي على PJC اثنين من التحكم. في المقابل ، يجب أن يكون لخط IMCE من بقعة التزاوج نمو ملتقى على خط الرأس والعديد من المستعمرات في الخط الثاني. تظهر هاتان الصورتان التاليتان تعليق إعادة التثبيت من 10 إلى سالب اثنين من التخفيف لبقعة التزاوج على TY streptomycin xgl agar ، وعلى TY streptomycin Gentamycin xgl agar على TY streptomycin Gentamycin xgl agar.

المستعمرات الزرقاء هي مؤتلفات مفردة. في حين أن المستعمرات البيضاء عبارة عن إنتجرينات عابرة خضعت لتبادل كاسيت حقيقي عند عرضها تحت الضوء الأخضر ومن خلال مرشح أحمر ، فإن الميل إلى التخفيف السلبي لتعليق بقعة التزاوج على TY strept cin xgl agar يفتقر إلى التألق. في المقابل ، فإن التخفيف 10 إلى ناقص اثنين من تعليق مقاومة بقعة التزاوج على Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agar يظهر مستويين من التألق.

تتوافق المستعمرات الأكثر إشراقا مع المستعمرات الزرقاء ولها تعبير RFP أعلى ، ويفترض أنه يرجع ذلك إلى تعزيز القراءة من محفز LAC في المتجه. تتوافق المستعمرات الأقل سطوعا مع المستعمرات البيضاء ، التي خضعت لتبادل حقيقي للكاسيت وتحتوي على RFP مع مروجها المباشر فقط وبدون قراءة من مروج LAC. يجب أن يكون المهاجرون في هذه الاتجاهات حساسين أيضا للبقع.

يجب أن تكون كفاءة الاندماج العابر عبر عن النسبة المئوية للمهاجرين المتحولين جنسيا إلى إجمالي المستلمين في حدود 0.5٪ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الاقتران البكتيري باستخدام سلالات هندسية لإدخال تركيبات الحمض النووي في الكروموسوم البكتيري.