الكشف عن الرشاشيات الرئوي الغازية في الخباثة المرضى باستخدام مكونات دم الاطراف تدفق التكنولوجيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح استخدام جهاز التدفق الجانبي للكشف السريع عن المستضد التشخيصي لفطر aspergillus في المصل البشري وسوائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL). يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وضع عينة المصل أو عينة BAL في منفذ التحرير الخاص بجهاز التدفق الجانبي. وتتمثل الخطوة الثانية في السماح للمحلول بالهجرة على طول الغشاء.

تتمثل الخطوة التالية في تحديد ما إذا كان الاختبار صالحاً من خلال فحص خط التحكم الداخلي. والخطوة النهائية هي تفسير نتيجة الاختبار عن طريق فحص خط الاختبار. وفي نهاية المطاف، يُستخدم جهاز التدفق الجانبي للكشف عن وجود المستضد التشخيصي لـ aspergillus في المصل أو سوائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL).

يمكن استخدام اختبار التدفق الجانبي (LFD) الخاص بـ aspergillus كاختبار تكميلي لتشخيص داء الرشاشيات الرئوي الغازي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المقايسة المناعية الإنزيمية لـ aspergillus و galacto و Manan، ومقايسة panf و fundal و beta glucan، واختبار aspergillus PCR، في كونها اختباراً تشخيصياً سريعاً في نقطة الرعاية يتطلب الحد الأدنى من التجهيزات المخبرية والتدريب. وعلى الرغم من أن اختبار LFD قد تم تطويره للكشف عن أنواع aspergillus، إلا أنه يمكن أيضاً تطبيق تقنية التدفق الجانبي للكشف عن مسببات الأمراض المعدية الأخرى مثل أنواع cetosporium و fusarium و riser.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية من خلال دمج الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بهذه الكائنات. ونظراً لأن تفسير نتائج اختبار التدفق الجانبي (LFD) يتطلب التعرف على تنسيق المقايسة، فمن أجل جمع المصل من عينات الدم غير المعالجة، يُترك الدم ليتجلط عند درجة حرارة 4 °C. ويجب تخزين المصل وسوائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BAL) على شكل حصص (aliquots) عند درجة حرارة -20 °C قبل الاستخدام؛ حيث إن التخزين في شكل حصص يقلل من احتمالية تحلل المستضد المستهدف الناتج عن تكرار عمليات التجميد والإذابة للعينات أثناء الاختبارات المتكررة. ولتحضير عينات المصل وسوائل BAL للاختبار، تُذاب العينات في درجة حرارة الغرفة، ثم تُحفظ على الثلج، وتُخلط جيداً باستخدام جهاز الـ vortex، ثم تُوضع في جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بسرعة 14,000 RPM. وبالنسبة للاختبار الروتيني للعينات البشرية، يُخفف المصل بنسبة 1:1 باستخدام وسط زراعة الأنسجة، أو بدلاً من ذلك، ولفصل المستضد المستهدف عن المعقدات المناعية في المصل، يُخفف المصل بنسبة 1:2 باستخدام محلول PBS الذي يحتوي على 4% EDTA، ثم يُسخن لمدة ثلاث دقائق في حمام مائي مغلي ويُوضع في جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق بسرعة 14,000 RPM.

لا تتطلب سوائل غسل القصبات والأسناخ (BAL) البشرية أي معالجات أولية. وبمجرد إذابة عينة BAL بالتجميد وخلطها بجهاز الفورتيكس وطردها مركزياً، تصبح عينة نقية يمكن تطبيقها مباشرة على جهاز التدفق الجانبي. ولأغراض الاختبار، تُخزن أجهزة التدفق الجانبي أو LFD في درجة حرارة الغرفة أو 23 درجة مئوية، حيث تظل مستقرة لمدة 12 شهراً.

لبدء المقايسة، أخرج الأجهزة من أغلفتهما وضعها على سطح مستوٍ. وباستخدام طرف ماصة معقم، ضع 100 µL من المصل المعالج مسبقاً في منفذ التحرير الخاص بالجهاز خلال ثوانٍ معدودة. يجب أن ينتقل السائل عن طريق الخاصية الشعرية على طول غشاء نترات السليلوز الموجود في نافذة الملاحظة.

وبالطريقة ذاتها، ضع 100 µL من عينة BAL نقية في منفذ التحرير الخاص بالجهاز. اترك المقايسة تعمل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وعندها يجب تسجيل نتائج الاختبار. يجب ألا يُترك الاختبار لأكثر من 15 دقيقة قبل تسجيل النتائج.

بما أن هذا قد يؤثر على تفسير النتائج، فإن التفاعل الضعيف لن يتحسن عن طريق تمديد فترة التحضين. يتكون اختبار التدفق الجانبي (LFD) من خط تحكم داخلي يشار إليه بالحرف C على الغلاف البلاستيكي وخط اختبار يشار إليه بالحرف T. يجب أن يظهر خط التحكم دائماً بغض النظر عن وجود مستضد aspergillus في عينة المصل أو غسيل القصبات والأسناخ (BAL). وهذا يشير إلى أن المقايسة قد تمت بشكل صحيح في حال وجود مستضد aspergillus في عينة المصل أو غسيل القصبات والأسناخ (BAL).

سيظهر خط الاختبار أيضاً خلال 15 دقيقة من وضع العينة. وتتناسب كثافة تفاعلات خط الاختبار وخط Lyme طردياً مع تركيزات المستضد المستهدف في عينات المصل وVAL. ويعد تفسير نتائج الاختبار الجانب الأكثر تحدياً في هذا الإجراء.

يجب قراءة نتائج اختبار التدفق الجانبي (LFD) عند مرور 15 دقيقة، ومقارنة نتيجة الاختبار بالمثال المرجعي الموضح هنا. تعرض هذه الصورة أمثلة مرجعية لنتائج LFD ضعيفة الإيجابية، وإيجابية متوسطة، وإيجابية قوية باستخدام عينات من سائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL) وعينات مصل. إن ظهور أي خط اختبار إيجابي في عينة المصل، بغض النظر عن شدته، يشير إلى الإصابة بداء الرشاشيات الغزوي (invasive pulmonary aspergillosis) أو مرض IPA نتيجة وجود مستضد الرشاشيات المتداول في مجرى الدم. أما التفاعلات الإيجابية في عينات BAL، بغض النظر عن شدتها، فتشير إلى إنبات الأبواغ وتطور خيوط فطرية قد تكون ممرضة في الرئتين.

في حالة غياب مستضد aspergillus، لن يظهر أي خط اختبار وتُسجل النتيجة على أنها سلبية. يوضح هذا الجدول نتائج اختبارات LFD باستخدام سوائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL) من مرضى سرطان الدم النقوي الحاد أو مرضى ML الذين تم تشخيصهم وفقاً للمعايير التشخيصية للمجموعة الدراسية التابعة للمنظمة الأوروبية لأبحاث وعلاج السرطان والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. يتضمن هذا الجدول البيانات السريرية والنفسية المقابلة، بالإضافة إلى نتائج اختبار PCR الخاص بـ ASPERIA لكل مريض.

بموجب إرشادات E-O-R-T-C-M-S-G لعام 2002، تم تشخيص المرضى 12 و13 و16 بإصابة محتملة بـ IPA بناءً على عوامل المضيف والمعايير السريرية أو إيجابية GM. ووفقاً لإرشادات E-O-R-T-C-M-S-G المنقحة لعام 2008، فإن عوامل المضيف وإيجابية GM بمفردها، أو عوامل المضيف والمعايير السريرية بمفردها، لن تشير إلى عدوى فطرية غازية محتملة ما لم تكن مصحوبة بأدلة داعمة من البيانات السريرية وعلم الفطريات على التوالي. أما المريض رقم ستة، فقد تم تشخيصه بإصابة مرجحة بـ IPA بموجب إرشادات عامي 2002 و2008 بسبب عوامل المضيف والميزات السريرية الرئيسية والثانوية وإيجابية GM.

أخيراً، يرجى ملاحظة أنه على الرغم من أن مقايسة LFD ومقايسة PCR غير مدرجتين حالياً ضمن إرشادات E-O-R-T-C-M-S-G في عينات BAL للمريضين السادس والثاني عشر، إلا أن هناك توافقاً قوياً بين هذين الاختبارين واختبار galactomannan التجاري، مما يشير إلى وجود مستضد وحمض نووي لـ aspergillus بعد اتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى بالتوازي لتأكيد المرض الفطري الغازي، مثل مقايسة Pella Glactomannan الإنزيمية الأمينية، أو اختبار panf، أو اختبار beta-glucan الفطري، أو اختبارات aspergillus PCR. لا تنسَ أن العمل مع مصل الدم البشري وسوائل BAL يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب أن يكون مشغلو الجهاز دائماً محصنين ضد أمراض مثل التهاب الكبد B والسل.