المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

يوضح هذا الفيديو بروتوكولاً لعزل وتوصيف المظاهر الشكلية للخلايا السلفية المكونة للدم باستخدام الفصل المعتمد على الخرز المغناطيسي وفرز الخلايا المنشط بالفلورة. أولاً، يتم تشريح الساق الخلفية وعظمة الفخذ والظنبوب والنخاع الشوكي من فأر، ثم تُجانس لإنتاج معلق من خلايا نخاع العظم. بعد ذلك، يتم إثراء هذه المجموعة من الخلايا التي تعبر عن C kit باستخدام تدفق الخرزات المغناطيسية الدقيقة.

يُظهر التحليل السيتومتري للمجتمع الخلوي المُغنى أن هذه الطريقة تنتج سلالة مكونة للدم وخلايا سلفية وخلايا جذعية مكونة للدم عالية النقاء، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك في الدراسات الوظيفية في المختبر وفي الجسم الحي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل شطف العظام، في أنها تتيح استعادة خلايا نخاع العظم بشكل أسرع وأكثر كفاءة. وتمتد تطبيقات هذه التقنية إلى علاج أو تشخيص الالتهابات، وأمراض المناعة الذاتية، ونقص المناعة، والأمراض التنكسية، والاضطرابات الأيضية، ونماذج المناعة السرطانية، لأنها تتيح التوصيف المظهري والتحليل الوظيفي خارج الجسم للخلايا السلفية المكونة للدم.

وبالتالي، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة لمراقبة عملية تكوين الدم في ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. كما يمكن استخدامها لدراسة نقل إشارات بيولوجيا الخلية والتعبير الجيني المنظم نموياً في مجموعات فرعية متميزة من الخلايا السلفية. ابدأ بوضع فأر تم قتله رحيماً في وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ.

يُرش البطن والظهر بـ 70%ethanol لجمع العظام التي ستُستخدم كمصدر للخلايا. استخدم مقصاً لعمل فتحتين صغيرتين في الجلد عند الأرجل الخلفية، وبمساعدة الملقط يتم خلع عظمة الفخذ، ثم يُقلب الفأر رأساً على عقب ويُقطع الجلد طولياً. ولإظهار العمود الفقري، يتم إزالة العمود الفقري.

بعد ذلك، وباستخدام مقص ذي طرف مدبب، قم بإزالة جميع بقايا الأنسجة الرخوة بعناية من العمود الفقري. واستخدم الشاش لإزالة بقايا الأنسجة الرخوة من عظم الفخذ وعظم الظنبوب.

بعد ذلك، ضع العظام في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter يحتوي على 30 milliliters من وسط RPMI.Medium المدعم. ضع العديد من المرشحات المعقمة مقاس أربعة أخماس في هاون معقم. ثم وباستخدام ملقط، انقل العظام إلى الهاون وقم بتغطيتها بطبقة أخرى من المرشحات لتشكيل سطح احتكاك.

ضع بعد ذلك مصفاة خلايا بمسام 40 micron في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. ثم وباستخدام مدقة، اسحق العظام حتى يتم الحصول على معلق خلوي متجانس. وباستخدام ماصة، انقل المعلق إلى مصفاة الخلايا.

بعد ذلك، أضف خمسة ملليلترات من وسط RPMI الطازج والمُكمّل إلى الهاون لغسل وحصاد الخلايا المتبقية عن طريق السحب والتفريغ بالمصّة. ثم أضف وسط RPMI إلى الأنبوب الذي يحتوي على المرشح. كرر الخطوتين الأخيرتين حتى تبدو العظام المتجانسة صافية.

بمجرد مرور المحلول عبر المرشح، انقله إلى أنبوب جديد سعة 50 milliliter وكرر عملية الترشيح للتخلص من بقايا الأنسجة المتبقية. استخدم جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 500 times G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع degrees Celsius، ثم قم بإزالة السائل الطافي بعناية عن طريق الشفط. تأكد من عدم تحريك كتلة الخلايا المترسبة.

تتمثل الخطوة التالية من الإجراء في توصيف الأنماط الظاهرية للسلف المكون للدم. ابدأ بإعادة تعليق كتلة الخلايا من كل فأر في 15 milliliters من PBS و 2%FBS. ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C وأزل الراشح بعناية عن طريق الشفط.

تجنب تعكير الراسب. قم بإعادة تعليق الراسب في 5 mL من PBS و2% FBS وعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). وبمجرد تحديد تركيز الخلايا، انقل 1 × 10⁵ من الخلايا إلى كل بئر في طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً.

بعد ذلك، قم بطرد الطبق مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق. وأثناء عملية الطرد المركزي، قم بتحضير مزيج من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الموجهة ضد المؤشرات السطحية المدرجة هنا في محلول PBS و 2%FBS لصبغ الخلايا. وبمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي عن طريق قلب الطبق، ثم أضف 50 µL من مزيج الأجسام المضادة إلى كل بئر.

بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات واسحب السائل للأعلى والأسفل لتفكيك الخلايا إلى معلقات من خلايا مفردة. حضن الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة 4 °C، وبعد انتهاء فترة التحضين، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 150 µL من PBS و 2%FBS. ثم قم بطرد مركزي للطبق بسرعة 500 ×g لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، تخلص من السنا (senna) عن طريق قلب الطبق. بعد ذلك، أضف 50 µL من AP three size seven strept adin المخفف بنسبة 1:300 في PBS مع 2% FBS إلى كل بئر، ثم قم بتفكيك الخلايا إلى معلق من الخلايا المفردة عن طريق السحب والضخ بالماصة. قم بتحضين الخلايا لمدة 10 دقائق في الظلام عند درجة حرارة 4 °C، وذلك بعد عملية التحضين.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام 150 µL من PBS و2%FBS. بعد طرد الطبق مركزياً، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 100 µL من PBS و2%FBS، ثم حلل العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي. لفرز مجموعات فرعية محددة من الخلايا المكونة للدم، يتم إجراء إثراء مغناطيسي لنخاع العظم لإثراء الخلايا الإيجابية. أعد تعليق راسب الخلايا من نخاع العظم المستخلص من 10 فئران على الأقل في 1 mL من المحلول المنظم الذي يحتوي على الجسم المضاد أحادي النسيلة الخاص بالمجموعة C والمقترن بـ PC والمخفف بنسبة 1:50.

تُحضن الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة أربع درجات Celsius بعد عملية التحضين. تُغسل الخلايا مرتين باستخدام 40 milliliters من المحلول المنظم. بعد الطرد المركزي، يُزال السائل الطافي بعناية عن طريق الشفط.

ثم أضف 50 µL من حبيبات anti A PC الدقيقة لكل فأر مباشرة إلى الراسب. اخلط جيداً وحضن لمدة 20 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة 4 °C، ثم اتبع خطوات الغسيل والتدوير للخلايا كما سبق. بعد ذلك، أعد تعليق راسب الخلايا في 4 mL من المحلول المنظم. لكل ثلاثة فئران، ضع أعمدة max LS في المجال المغناطيسي لفاصل max مناسب.

قم بتجهيز الأعمدة عن طريق شطفها بأربعة لترات من المحلول المنظم. بعد ذلك، أضف معلق الخلايا وقم بجمع الخلايا غير الموصومة التي تمر عبر العمود في أنبوب تجميع. اغسل العمود بأربعة لترات من المحلول المنظم ثلاث مرات.

أضف محلولاً منظماً جديداً عند نفاد الخزان في العمود. وبمجرد تدفق المحلول بالكامل، تخلص من السائل المتدفق، ثم انزع الأعمدة من جهاز الفصل وضع كل واحد منها فوق أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. انقل بواسطة الماصة 4 milliliters من المحلول المنظم إلى كل عمود، وقم فوراً بغسل الخلايا الموصومة مغناطيسياً عن طريق دفع المكبس داخل العمود.

قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق. أزل الطافي بعناية عن طريق الشفط. أعد تعليق كل راسب في 1 مل من المحلول المنظم، واجمع الرواسب في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل.

بمجرد إثراء مجموعة الخلايا الموجبة لـ sea kit، يتم صبغ الخلايا وفرزها بواسطة FACS. تم فرز السلفيات المكونة للدم والخلايا الجذعية المكونة للدم من معلق نخاع عظمي تم إثراؤه بالخلايا الموجبة لـ sea kit باستخدام الخرزات المغناطيسية، كما تم فرز LT HSC و THSC وفقاً للتعبير عن الجزيئات السطحية كما هو موضح في هذا الفيديو. يوضح هذا الشكل مثالاً لإجراء البوابة الإلكترونية لتقدير السلفيات اللمفاوية المشتركة كـ linin.

انظر إلى الخلايا الموجبة لـ interleukin seven R المنخفضة. خلايا Lin minus الموجبة لـ see it والموجبة لـ scar one، وخلايا linin الموجبة لـ see kit والموجبة لـ scar one. خلايا منخفضة من بوابة SEE kit الموجبة.

يتم تحديد السلف النخاعية الشائعة على أنها خلايا موجبة لـ CD 34 ومنخفضة لـ FC gamma R. وكذلك من بوابة الخلايا الموجبة لـ C kit، يتم تحديد سلف الخلايا المحببة والوحيدة على أنها خلايا موجبة لـ CD 34 ومرتفعة لـ FC gamma، بينما يتم تحديد سلف الخلايا المكونة للصفيحات والخلايا الحمراء على أنها خلايا سالبة لـ CD 34 ومنخفضة لـ FC gamma. ومن مجموعة LKS، يتم تحديد L-T-H-S-C و S-T-H-S-C على أنها خلايا سالبة لـ CD 34 وموجبة لـ CD 34 على التوالي. وبذلك، يتم الحصول على مجموعتين مخصبتين وعاليتي النقاوة تتواجدان فسيولوجياً بأعداد قليلة، وذلك لدراسة تأثير المناعة الذاتية على تكوين الدم في HSCs من الفئران الضابطة والفئران المصابة بمرض التهاب الأمعاء.

صُبغت بـ KI 67 antibody و DPI كما يتضح هنا. وبالكاد يمكن اكتشاف الخلايا في مرحلة الانقسام، إن وجدت، في مقصورة الخلايا الجذعية المكونة للدم LKS CD 34 negative في ضوابط المجموعة السليمة. وفي المقابل، تزداد المجموعات الفرعية ذاتها من الخلايا بشكل ملحوظ أثناء مرض IBD، ويتم اكتشاف عدد كبير من HSCs في مرحلتي SG two M من الدورة الخلوية.

مما يشير إلى أن الالتهاب المزمن بوساطة الخلايا التائية يحدد دخول الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) في الدورة الخلوية. ولتقييم وجود ATP مخزن في الحويصلات، تم صبغ الخلايا سالبة CD34 من الفئران السليمة بمركب الكينين الرابط للنوكليوتيدات، وكشف تحليل اللون الأحمر النووي بواسطة المجهر البؤري للخلايا الحية أنه في HSCs وليس في GMPs، كانت الحويصلات الموجبة للكينين مرئية في السيتوبلازم. ولتحديد ما إذا كانت HSCs تستجيب لـ ATP خارج الخلية، تم تحليل استجابة الكالسيوم للخلايا الجذعية المكونة للدم المفروزة والمحملة بـ 4 0 2 والمحفزة بـ ATP وionomycin كما هو موضح هنا. وتشير مخططات ارتفاع الكالسيوم في الخلية الواحدة إلى وجود زيادة في كالسيوم السيتوبلازم في LT HSC عن طريق تنشيط مستقبلات P2 غير الاستجابية النقية.

عند التعرض لـ TP، بما أن ارتفاع مستويات الكالسيوم في العصارة الخلوية يحفز إطلاق ATP الحويصلي. تشير هذه التجربة إلى أن TP قد ينظم عملية إطلاقه من HSCs، وتثبت أن هذا الإجراء يمكن استخدامه في الدراسات الوظيفية لـ HSCs. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل neurone topo stem cells والأسلاف الملتزمة بسلالات معينة لإجراء المقاييس الوظيفية. عقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل إعادة بناء الفئران المستقبلة غير المشععة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل إمكانية إعادة بناء HSCs المنقاة من C State أو البيئة الالتهابية.