الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح استخدام تقنية تدفق الصور لقياس الآليات الخلوية للخلايا المناعية الأولية من مجموعات مرضى محددة بدقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي أو pbmc من عينات دم تم الحصول عليها من المرضى أو متطوعين أصحاء. وبعد العزل، يتم تنشيط الخلايا ثم وسمها بفلورسنت.

بعد ذلك، يتم تركيز الخلايا هيدروديناميكياً، وتحفيزها بضوء الليزر وتصويرها باستخدام تكامل تأخير الوقت. كاميرا CCD. وأخيراً، يتم الحصول على الصور باستخدام مقياس التدفق الخلوي التصويري وقياس كمية NF kappa b.

يتم إجراء عملية النقل في كل صورة خلوية باستخدام برنامج ideas. وفي النهاية، يمكن تحديد الفروق بين كل مجموعة من الخاضعين للدراسة من خلال تحليل المخططات النقطية، والمخططات التكرارية، والصور الخلوية. وتكمن ميزة تدفق الصور في أنها تجمع بين الحقائق والفلورة المناعية.

نحن قادرون على دراسة مسارات إشارات الخلايا بطريقة محددة للسلالة، سواء على مستوى الخلية الواحدة أو المجتمع الخلوي، وذلك بالبدء بعينة صغيرة فقط من الدم. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة عن أسئلة معرفية جوهرية من خلال تحديد موقع وكمية الوسائط الإشارية. على سبيل المثال، يمكن استخدامها لاستقصاء الانتقال النووي للعوامل الشفافة بوساطة فعل معين أو لدراسة تأثيرات الشيخوخة على بيولوجيا الخلية.

سيقوم الباحث الأول من مختبري بتوضيح التقنية بعد عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي التي تم الحصول عليها من متطوعين بشريين. قم بإعادة تعليق خلايا p BMCs المستعادة بتركيز 3 × 10⁶ خلية لكل 0.6 milliliters من الوسط، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنابيب سعة 1.5 milliliter. بعد ذلك، قم بتحفيز بعض الخلايا باستخدام عامل تنشيط مثل TLR8 ligand R848 الموضح هنا، ثم حضن جميع الخلايا عند 37 °C لمدة تتراوح من 10 إلى 60 دقيقة في حاضنة تحتوي على 5% carbon dioxide.

بعد فترة التحضين، يتم تجميع الخلايا في شكل قرص (pellet) لمدة خمس دقائق عند 500 ×g في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم التخلص من السائل الطافي، وتوسيم الخلايا باستخدام خليط من الأجسام المضادة السطحية النوعية لسلالات الخلايا الوحيدة (monocyte) أو الخلايا التغصنية (DC) لمدة 20 دقيقة عند 4 °C، بما في ذلك أنابيب تحتوي على خلايا موسومة بمركبات ذات لون واحد لاستخدامها كضوابط للتعويض (compensation controls). بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا في 4% PFA-PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد طرد الخلايا مركزياً لمدة 10 دقائق عند 500 ×g في درجة حرارة الغرفة، يتم إعادة تعليق خلايا pbmc في محلول التجميد وتخزين الخلايا عند -80 °C حتى يتم تحليلها في يوم المقايسة.

قم بإذابة الخلايا سريعاً في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C، ثم بعد إجراء عملية الطرد المركزي لإزالة محلول التجميد، قم بنفاذيتها باستخدام 100 µL من محلول غسيل النفاذية (BD perm wash buffer). بعد ذلك، قم بوسمها باستخدام أجسام مضادة لمكونات التأشير داخل الخلوية، مثل أجسام NF kappa BP 65 المضادة الموضحة هنا، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد تجميع الخلايا في راسبة، أعد تعليقها في 100 µL من محلول غسيل النفاذية (BD perm wash buffer) الذي يحتوي على أجسام مضادة من الماعز ضد IgG الأرنب.

استخدم Alexa 647 واحضن الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. وقبل التصوير مباشرةً، قم بصبغ الخلايا بصبغة نووية معاكسة؛ ابدأ بتشغيل جهاز image stream ثم قم بتشغيل برنامج inspire. بعد ذلك، انقر على تحميل القالب الافتراضي (load default template) ثم اختر تهيئة السوائل (initialize fluidics).

بعد ذلك، انقر على قائمة معرض الصور وحدد الكل. الآن اضغط على "تشغيل الإعداد" (run set up) لبدء تصوير الخرزات، ثم اختر قناة المجال المضيء (bright field channel). وبمجرد تشغيل خرزات السرعة (speed beads)، انقر على "بدء الكل" (start all) ضمن علامة تبويب المساعدة (assist tab) لمعايرة الجهاز واختباره.

بعدما يتم معايرة نظام ImageStream، اضغط على flush, lock and load لتحميل العينة الأكثر سطوعاً في الجهاز. ثم اضبط قدرة الليزر بحيث يكون لكل flora chrome قيمة بكسل قصوى تتراوح بين 104,000 counts كما يتم قياسها في المخططات النقطية. بعد ذلك، حدد معايير تصنيف الخلايا.

الآن انقر على "run"، ثم "acquire" لجمع وحفظ ملف بيانات التجربة. لتحليل ملفات البيانات أولاً، افتح برنامج ideas. Analytical software لإنشاء ملفات صور مُعوضة، ثم قم بعمل بوابة (gate) للأحداث التي تظهر كثافة صبغة نووية طبيعية ونسبة باعية عالية للصبغة النووية. ولتمييز الخلايا المفردة في البوابة R1 عن الحطام أو الأحداث متعددة الخلايا، توجد الخلايا الوحيدة (monocytes) ضمن بوابة الخلايا الموجبة لـ CD 14، بينما تقع الخلايا التغصنية النخاعية (myeloid dendritic cells)، التي تتميز بكثافة عالية لـ CD 11 C وكثافة منخفضة لـ CD 4 وعلامات lin 1، في البوابة R3.

وأخيرًا، استخدم برمجيات ideas لتحديد التوضع المشترك لعامل النسخ السيتوبلازمي NF kappa B مع صبغة النواة. يشير الارتباط العالي بين NF kappa B وصبغة النواة إلى التوضع المشترك للمؤشرين، وهو ما ينعكس في درجة تشابه عالية ويدل على درجة تنشيط الخلية. ويمكن مقارنة النسبة المئوية لأحداث التشابه العالي بين مجموعات العلاج المختلفة أو مجموعات المرضى لتقييم الكفاءة الوظيفية النسبية للخلايا باستخدام برنامج ideas.

يمكن بعد ذلك استخدام البرمجيات لعرض صور الخلايا من المقاطع الرئيسية لمخططات توزيع التكرار السكانية. ويتيح نظام ImageStream فرز مجموعات فرعية من الخلايا مباشرة من خلايا pbmc وتصوير استجابات الخلايا من المجموعات التي تم فرزها ولكن لم يتم فصلها. وهنا، تم قياس تأثير تأشير TLR على التموضع النووي لـ NF kappa BP 65 في خلايا myeloid dcs التي كانت lin one، negative CD four، dim CD 11 C positive عند المستوى المرجعي.

لوحظ وجود نسبة عالية من الخلايا غير المحفزة التي تحتوي على عامل النسخ NF kappa BP 65 في السيتوبلازم. وبعد التحفيز، تبين أن الخلايا المعالجة تمتلك درجة تشابه أعلى بشكل ملحوظ بين NF Kappa BP 65 وصبغة النواة PI، مما يشير إلى انتقال NF Kappa BP 65 إلى النواة بعد التحفيز. وتُظهر الصور الرقمية التي تم جمعها في وقت واحد لمجموعات الخلايا غير المعالجة، أو المحفزة بـ R 8 48، خلايا ممثلة وكثافة انتقال NF kappa B إلى نواة الخلية. يلاحظ زيادة كثافة تلوين NF Kappa B و PI في المجموعة المحفزة بـ R 8 48 مقارنة بالخلايا غير المعالجة.

لقد استخدمنا هذه التقنية على خلايا من متبرعين في أعمار مختلفة وأظهرنا اختلافات في مسارات تنشيط NF kappa B بوساطة TLR. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون يوم واحد مع وقت إضافي لتحليل الصور، مما يسمح بالحصول على العديد من صور التوضع وإحصائيات التجمعات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا تصوير الاستجابات مباشرة من تجمعات خلوية متعددة دون الحاجة إلى فصل فيزيائي. يمكن تطبيق Image stream على نطاق واسع في عدد من الآليات الخلوية، ومن شأنها أن تكون ذات قيمة كبيرة في الأبحاث الانتقالية.