إعداد الفأر استيقظ لتسجيل الردود العصبية وحقن الراسمات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل الاستجابات من الخلايا العصبية المفردة في فأر مستيقظ. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير الفأر أولا باستخدام استنشاق الفلور ، ووضع الفأر في إطار تجسيمي للقوارض وتعريض الجمجمة. الخطوة الثانية هي تحديد منطقة الدماغ ذات الاهتمام باستخدام الإحداثيات التجسيمية وتحديد هذه المنطقة لحج القحف اللاحق.

بعد ذلك ، يتم تثبيت عمود رأس مصنوع خصيصا على الجمجمة ويتم وضع عمود الرأس في قضيب تثبيت متصل بمناور دقيق على الجهاز التجسيمي. الخطوة الأخيرة هي إجراء حج القحف للسماح بإدخال قطب كهربائي في الدماغ. بمجرد أن يتعافى الفأر من الجراحة ، يتم تقييد الفأر في كتلة رغوية.

يتم وضع عمود الرأس مرة أخرى في قضيب التثبيت وتوصيله بجهاز تجسيمي مخصص ، ويمكن إدخال قطب كهربائي ماصة صغيرة في الدماغ. يسمح هذا الإجراء بعزل الوحدات الفردية. يمكن تسجيل الاستجابات القوية للمنبهات من نفس بنية الدماغ على مدار عدة أيام ، ويمكن استخدام الآثار لفحص الإسقاطات الصاعدة أو الهابطة إلى المناطق المحددة فسيولوجيا أو دون التأثير على الاستجابات بأدوية التخدير.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن خصائص استجابة الخلايا العصبية لا تتأثر بالتخدير. يوضح هذا الإجراء زاكاري ماكو ، طالب دراسات عليا من مختبري لإعداد مسند الرأس ، أولا ، قم بتجميع عمود رأس مصمم خصيصا عن طريق حفر ثقب في قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 15 ملم ، وثلاثة أكثر من 32 بوصة. ثم أدخل دبوس لفة من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 20 ملم بشكل عمودي في الحفرة.

لتشكيل تقاطع ، اضغط على أحد طرفي القضيب الرأسي لقبول المسمار رقم 1 72 كما هو موضح هنا. بعد ذلك ، جهز شريط التركيب. تتكون قطعة الجهاز هذه من قضيب أطول من النحاس أو الألومنيوم يبلغ طوله حوالي 90 ملم وعرضه من خمسة إلى 10 ملليمترات ، وقضيب أقصر بطول 15 ملم متصل بنهاية الشريط الطويل عند 45 درجة.

يحتوي الشريط الأقصر على أخدود واحد مقطوع في الأسفل وأخدود أقصر عبر العرض يناسب عمود الرأس في هذه الأخاديد مع وجود القطعة المتقاطعة في الأخدود الأقصر. كتلة التثبيت عبارة عن قطعتين من الألومنيوم مزودة بمسامير لتشكيل كتلة من حوالي 30 ملم × 30 ملم × 25 ملم مع فتحة لتثبيت شريط التثبيت ، أدخل شريط التثبيت في الفتحة في كتلة التثبيت الموازية لسطح الطاولة. قم بتوصيل كتلة التثبيت بمناور صغير بحيث يمكن وضع موضع عمود الرأس بدقة على طول خط الوسط والبريما.

أخيرا ، قم بقطع قضيب تنغستن بقطر 0.01 بوصة إلى ما يقرب من خمسة ملليمترات في الطول مع ثني ملليمتر واحد تقريبا عند 45 درجة. هذا القضيب بمثابة دبوس الأرض. بعد وضع في غرفة الحث مع 5٪ من الثلج من الفلور ، تأكد من تخدير بالكامل عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم والتحقق من عدم وجود رد فعل.

بمجرد تخديره بالكامل ، ضع الماوس في إطار القوارض التجسيمي المزود بمحول الماوس عن طريق وضع الأسنان أولا داخل فتحة قضيب اللدغة وشد مشبك الأنف برفق حتى يصبح دافئا. للتأكد من أن يظل مخدرا. ضع قناع الوجه المصنوع من قطعة من قفاز اللاتكس على أنف الفأر وحافظ على 5٪ من الفلور حتى يصبح معدل التنفس نفسا واحدا تقريبا في الثانية.

بعد ذلك الوقت ، قلل من الفلور إلى 1.5 إلى 2٪ الآن قم بتأمين الرأس عن طريق وضع قضبان الأذن برفق في كل قناة أذن. مع الحرص على عدم ثقب طبلة الأذن ، قم بتثبيت قضبان الأذن بحيث تكون دافئة ، ولكن لا تخترق بعمق قنوات الأذن. ضع وسادة تسخين جل أسفل الماوس.

ثم ضع مرهم العين برفق لمنع العينين من الجفاف. استخدمه باستخدام ماكينة حلاقة صغيرة أو مقص دقيق. إزالة الشعر من بين الأذنين حتى العينين.

الآن قم بتنظيف وتعقيم فروة الرأس باستخدام فرك الكلورهيكسيدين أو البيتادين ، متبوعا بشطف الكحول المتكرر ثلاث مرات. قم بعمل شق على طول خط الوسط من مؤخرة الرأس إلى العينين. اكشط السمحاق على حواف الشق بمشرط إذا لزم الأمر.

اسحب العضلات في مؤخرة الرقبة بعناية باستخدام ملقط مع السماح للعضلات بالتمزق على طول العوارض لتقليل النزيف. ضعي رغوة الجل تحت أنسجة فروة الرأس لتقليل الرطوبة ومنع الجلد من التحرك فوق الجمجمة. ثم قم بترطيب قضيب قطني بالكحول الجانبي isop وجفف سطح الجمجمة لتعزيز تصور معالم الجمجمة.

بمجرد تحضير ، أدخل نقطة دقيقة. مسبار مثل قضيب معدني حاد في حامل القطب الكهربائي وإرفاقه بمناور دقيق التجسيم. حرك المسبار ذهابا وإيابا بين bgma و Lambda ، مع التأكد من أن الإحداثيات الإنسية الجانبية لكل موقع لا تزيد عن 50 ميكرون.

أعد وضع الرأس برفق باستخدام قضبان الأذن حسب الحاجة. تحقق من أن الارتفاع البطني الظهري في Bgma و Lambda يختلف بما لا يزيد عن 50 ميكرون. اضبط ارتفاع مشبك الأنف لتسوية درجة الجمجمة إذا لزم الأمر ، وقد يلزم أيضا تعديل ارتفاع قضيب الأذن.

استخدم أطلسا لدماغ الفأر لتحديد إحداثيات الهدف محل الاهتمام بالنسبة ل bgma. استخدم الحبر الهندي لتمييز الجمجمة فوق الهدف حيث سيتم إجراء بضع القحف. أولا ، قم بتنظيف الجمجمة عن طريق نشر جل حفر الأسنان على السطح والفرك لمدة 10 ثوان تقريبا.

ثم يغسل بالماء ويجف تماما. بعد ذلك ، ضع البرايمر اللاصق لأسمنت الأسنان على سطح الجمجمة. باستخدام قضيب ، ثم استخدم قضيبا جديدا لنشر المادة اللاصقة لمعالجة المادة اللاصقة بدورة واحدة من مسدس ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

تحديد موقع بعيد عن الموقع المستهدف. لتركيب الدبوس الأرضي ، استخدم طرف مشرط الشفرة الصغيرة رقم 65 لحفر ثقب صغير في الجمجمة بعناية. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون الثقب واسعا بما يكفي للنهاية القصيرة للدبوس الأرضي.

أدخل الدبوس الأرضي بحيث يستقر على السحايا. تأكد من توجيه الدبوس بحيث يشير بعيدا عن bgma وموقع مرفق عمود الرأس. الآن ، حرك المناور الصغير بحيث يتم وضع عمود الرأس فوق bgma فقط لمس الجمجمة.

يجب أن تكون قاعدة عمود الرأس مسطحة على الجمجمة. ثم استخدم مجسات التشريح لتطبيق كمية صغيرة من الأسمنت السني حول عمود الرأس ودبوس الأرض. اضغط على الأسمنت لأسفل لضمان ملامسة جيدة للجمجمة.

ثم يعالج بثلاث إلى أربع دورات من مسدس ضوء الأشعة فوق البنفسجية. أخيرا ، ضع جولة ثانية من الأسمنت لبناء القاعدة حول عمود الرأس وتغطية أخاديد عمود الرأس وعلاجنا. قبل تحديد موقع العلامة المرجعية لحج القحف أولا ، والتي سيتم حجبها جزئيا بواسطة التمهيدي.

ثم استخدم مشرط الشفرة الصغيرة رقم 65 لتمييز ثلاثة ملليمترات في ثلاثة ملليمترات مربعة حول هذا الموقع. ضع قطرة من محلول الليدوكائين لتقليل الحساسية. الآن قم بعمل عشرات متعددة على كل جانب من جوانب المربع ، مع الحرص على عدم قطع العظام إلى الدماغ.

بمجرد أن تصبح السديلة العظمية فضفاضة ، استخدم طرف المشرط لنقبها ، مع ترك الأم الجافية سليمة. ثم قم بتغطية المنطقة بشمع العظام. بمجرد اكتمال الجراحة، قم بإيقاف تشغيل الفلور الأيزو وحرر الماوس من الإطار التجسيمي.

ضع الليدوكائين على الجلد المكشوف ، متبوعا بمسحة الأبواغ الجديدة ، وقم بإدارة تسكين ما بعد الجراحة كما هو موضح من قبل الطبيب البيطري ، وأعد الفأر إلى القفص المنزلي. بعد 24 ساعة ، يمكن استخدام الفأر للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. يوضح هذا الشكل أن التثبيت الناجح لعمود الرأس يسمح للمجرب بتسجيل استجابات أحادية ومتعددة الوحدات من ماوس مستيقظ على مدار عدة أيام.

يسمح نظام التقييد بتسجيلات فيزيولوجية كهربية مستقرة للخلايا العصبية المفردة في الدماغ. يمكن تسجيل عزل ممتاز للوحدات الفردية والاستجابات القوية للمنبهات من نفس بنية الدماغ على مدى عدة أيام. على سبيل المثال ، في القولون السفلي للفأر على مدى يومين ، تعرض اللوحة اليسرى التسجيلات التي تم الحصول عليها من اليوم الأول واللوحة اليمنى في اليوم الثاني لتقييم الإسقاطات الهابطة من الدماغ المتوسط السمعي إلى جذع الدماغ السمعي ، البيوتينيل ، الداكسترا والأمين التي تم تصورها باستخدام دينو بينادين حيث يمكن حقن الكروموجين في القولون السفلي للفأر كما هو موضح هنا بعد تحديد خصائص الاستجابة العصبية في موقع الحقن و بعد معالجة الأنسجة.

يمكن تصور وضع العلامات على القوقعة الأمامية في نواة القوقعة الظهرية المقابلة ورسمها كما هو موضح هنا كما هو موضح هنا. يمكن أيضا الحصول على صور مجهرية بدقة أعلى لعرض المحاور والمحطات الطرفية المسماة إلى حد كبير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل خصائص الاستجابة من الخلايا العصبية الفردية وحقن الأصباغ أو أجهزة التتبع للدراسات التشريحية العصبية في فأر مستيقظ.

يزيل هذا المستحضر تأثير التخدير على خصائص الاستجابة العصبية ويسمح بإجراء التجارب على مدى عدة أيام مع نفس. مفتاح الإجراء هو التأكد من تثبيت عمود الرأس بإحكام على الجمجمة وأن الماوس مقيد جيدا. بينما أوضح هذا الفيديو كيفية استخدام هذا الإجراء للتسجيل من الخلايا العصبية الفردية في الجهاز السمعي ، يمكن دراسة مناطق أخرى من الدماغ باستخدام هذه التقنية.