عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

الهدف العام من هذا الإجراء هو اشتقاق خلايا ظهارية من مستنبتات نسيجية خلوية مختلطة ثلاثية الأبعاد من أجل تحليل تأثيرات الخلايا الليفية السدوية على بيولوجيا الخلايا الظهارية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إنشاء مستنبتات مشتركة من الخلايا الستيرويدية المختلطة ثلاثية الأبعاد. ثم يتم فصل الكريات عن مستنبت المصفوفة من أجل عزل الخلايا الظهارية بعد الاستنبات المشترك.

تتمثل الخطوة التالية في تمرير الخلايا الطلائية بعد الزراعة المشتركة حتى تصبح جاهزة للتحليل. وفي نهاية المطاف، يمكن تقييم تأثيرات التعرض للخلايا الليفية في الزراعة ثلاثية الأبعاد على سلوك الخلايا الطلائية من خلال التصوير المجهري للمزارع وتحليل ما بعد الزراعة المشتركة. الخلايا الطلائية، مثل التصوير الفلوري لغزو المصفوفة وهجرة Transwell كما هو موضح هنا، سيقوم كوين، وهو باحث مشارك من مختبري، باستعراض هذا الإجراء، والذي يتضمن إنشاء المزارع المشتركة في اليوم السابق.

أخرج الماتريجيل (Matrigel) من المجمد وأذب ثلجه على الثلج في ثلاجة بدرجة حرارة 4 °C طوال الليل. وفي يوم التجربة، ضع وسط الزرع على الثلج لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل خلطه مع الماتريجيل. لتخفيف الماتريجيل المذاب.

أضف نصف حجم وسط H Mac البارد جداً والمطلوب للزراعة المشتركة إلى أنبوب معقم موضوع على الثلج. ثم أضف إلى الأنبوب نفس الحجم (نصف الحجم الكلي) من الـ matrigel المذاب لتحقيق تخفيف بنسبة واحد إلى واحد، مع إبقاء الأنبوب على الثلج. بعد ذلك، ضع 50 microliters من خليط وسط الـ matra gel في منتصف الآبار المحددة في طبق زراعة يحتوي على 24 بئراً، ثم حضن الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 degree Celsius مع هواء مرطب و 5%CO2 لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، أضف 450 microliters إضافية من خليط وسط matrigel إلى الآبار واحضنها لمدة 60 minutes أخرى. وخلال فترة الحضن الثانية، قم بتحضير معلق بنسبة واحد إلى واحد من الخلايا الليفية (fibroblasts) والخلايا الظهارية (epithelial cells) بتركيز 0.5 × 10⁵ خلية في كل 0.5 milliliter من وسط H me. وعندما يتصلب خليط وسط matrigel، قم بإسقاط معلق الخلايا برفق فوق الجل وأعد المزرعة إلى الحاضنة لمدة يومين.

قم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام عن طريق سحب الوسط برفق شديد من جانب البئر واستبداله برفق بوسط HEC جديد، وراقب تكون الكرويات يومياً تحت المجهر وصورها حسب الاقتضاء باستخدام المجهر الضوئي أو المجهر الفلوري. ابدأ بسحب المزرعة صعوداً وهبوطاً بـ 10 مرات باستخدام ماصة زجاجية معقمة سعة 2 mL. ثم انقل المزرعة باستخدام الماصة الزجاجية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 mL، وقم بإجراء الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 350 ×g في درجة حرارة الغرفة؛ وبعد الطرد المركزي، ستترسب الكرويات الخلوية في قاع الأنبوب.

استخدم طرف ماصة باستور معقمة لإزالة هلام ماترا (matra gel) المتفكك بعناية من الجزء العلوي من جهاز الطرد المركزي. التحضير. أضف الآن 1 mL من وسط H mac إلى الراسب، ثم امزجه عن طريق السحب والطرد من 2 إلى 3 مرات باستخدام ماصة زجاجية معقمة سعة 2 mL، وانقل المزرعة إلى بئر في طبق زراعة أنسجة يحتوي على 24 بئراً. اترك الستيرويد ليلتصق بالطبق لمدة 48 ساعة على الأقل قبل تغيير الوسط.

بمرور الوقت، ستخرج الخلايا من البنية الكروية وتنمو كطبقات أحادية؛ وبعد أن تصل المزارع الخلوية إلى 50%Confluence، يتم نقلها باستخدام بروتوكول معياري إلى طبق بقطر 35 millimeter لمدة يومين إلى أربعة أيام، ثم تُنقل إلى طبق بقطر 100 millimeter لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام قبل إجراء المزيد من التحليلات للخلايا. استخدم ماصة باستور معقمة لسحب الوسط، ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الكريات المتبقية يدويًا. في المزارع المشتركة للكريات ثلاثية الأبعاد، تؤدي الخلايا الليفية ذات التثبيط المهندس لـ TM one، كما هو موضح هنا في الأشكال d و E و F، إلى زيادة غزو المصفوفة بواسطة الخلايا الظهارية الثديية مقارنة بالخلايا الليفية الضابطة في الأشكال A و B و C. لاحظ البروزات الظهارية التي تغزو المصفوفة في الكريات التي تدمج خلايا ليفية مثبطة لـ TM one، كما تشير الأسهم في الشكلين D و F. أما الخلايا الليفية ذات التعبير المفرط المهندس لـ TM one الموضحة هنا في الأشكال JK و L، فقد أدت إلى تقليل الغزو بواسطة خط خلايا سرطان الثدي sum 1 59 مقارنة بالخلايا الليفية الضابطة في الأشكال GH و I؛ قارن بين غياب البروزات الظهارية في الكريات التي تدمج خلايا ليفية مهندسة لـ TM one وتلك التي تدمج خلايا ليفية ضابطة كما تشير الأسهم في الشكلين G و i بمجرد إنشاء كريات المزرعة المشتركة.

يمكن عزل المجموعات الخلوية من الستيرويدات عن طريق إعادة الزرع في سياق ثنائي الأبعاد. تُظهر هذه المجموعة المركبة من الصور المزارع تحت المجهر الضوئي والمجهر الفلوري بعد عزلها من مزرعة matrigel هنا. يمثل اليوم صفر التصوير مباشرة بعد العزل، بينما تشير الأيام واحد واثنان وخمسة إلى عدد الأيام بعد عملية العزل.

لاحظ كيف تزداد هالة الخلايا التي تغادر هذا الستيرويد بمرور الوقت. وفي النهاية، يتبقى ستيرويد شبحي يحتوي على عدد قليل جداً من الخلايا كما يوضح السهم هنا. ويبقى عدد قليل جداً من الستيرويدات بعد عملية إزالة الأشباح والترحيق.

يعتمد ذلك على معدلات النمو النسبية للخلايا التي تم اختبارها. قد تظهر مجموعات نقية من خلال التمرير المتسلسل (serial passage) أو يمكن فرزها باستخدام واسمات خلوية مناسبة. يتم تحليل عينات الأنسجة في هذا المثال عن طريق قياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، وذلك باستخدام الفلورية الخضراء والفلورية الحمراء لتحديد الخلايا الليفية المعبرة عن GFP والخلايا الظهارية المعبرة عن mCherry على التوالي، وذلك لتحديد المجموعات النسبية من الخلايا الظهارية والخلايا الليفية.

بعد العزل من المزرعة المشتركة ثلاثية الأبعاد (3D)، تحتفظ الخلايا الظهارية بالخصائص المكتسبة من المزرعة المشتركة مع الخلايا الليفية لفترات زمنية ممتدة، مما يتيح فرصة كافية للتحليل. في هذا المثال، أدى التعرض للخلايا الليفية التي تفتقر إلى TM one إلى زيادة الهجرة في خلايا H max التي تمت مزرعتها بشكل مشترك، واستمر ذلك لأسابيع بعد العزل من المزرعة المشتركة ثلاثية الأبعاد مقارنة بالتعرض للخلايا الليفية الضابطة والمشار إليها هنا بالرمز C بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تلك المستخدمة لتحليل التغيرات في التعبير الجيني والعلامات فوق الجينية للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتأثيرات الخلايا الليفية على الخلايا الظهارية.