TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا ضمة الكوليرا بناء على التحول الطبيعي وإعادة التركيب، FLP

الهدف من هذا الإجراء هو التلاعب وراثيا ب vio cray باستخدام هذه الطريقة السريعة والناقصة ، والتي تعتمد على التحول الطبيعي ومزيج الوجه. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير مصدر الكيتين المناسب أولا لأن الكيتين هو المحفز الطبيعي للتحول. خلال الخطوة الثانية ، يتم إنشاء بنية الحمض النووي باستخدام جولتين من تفاعل البوليميراز المتسلسل ويتم إجراء تحولها الطبيعي ، مما يسمح للبكتيريا المحتوية على PBR البلازميد بتناول جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل ودمجها في جينوماتها.

بعد ذلك ، يتم استخدام ارتفاع درجة الحرارة لتحفيز إنزيم الليباز المشفر بالبلازميد لإزالة هدف إعادة التركيب القابل للطي أو كاسيت مقاومة المضادات الحيوية المحاط بموقع FRT. في الخطوة الأخيرة ، يتم علاج البكتيريا من بلازميد ترميز FLP. في النهاية ، يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسلسل لإظهار أن التلاعب الجيني كان ناجحا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل استخدام البلازميدات الانتحارية للتلاعب الوراثي هي أن هذه الطريقة سريعة وفعالة للغاية. ابدأ بوزن عينات من 50 إلى 80 ملليغرام من رقائق الكيتين في أنابيب بلاستيكية قياسية سعة 1.5 مليلتر ، ثم إبقاء أغطية الأنابيب مفتوحة ، وقم بتعقيم الرقائق بعد أن يدعو الأوتوكلاف على الفور إغلاق الأغطية وتخزين مجموعة الأوتوكلاف في رقائق في درجة حرارة الغرفة ، وهناك حاجة إلى ستة قليل النوكليوتيدات على الأقل لتضخيم مناطق الحمض النووي ذات الأهمية ، بالإضافة إلى كاسيت المضادات الحيوية المحيطة ب FRT بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يوصى أيضا بتضمين زوج من بادئات قليل النوكليوتيدات خارج جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل المدخل.

يسمح ذلك بالتحقق من التكامل والاستئصال الصحيح لتصميم كاسيت مقاومة المضادات الحيوية المحاطة ب FRT ، ورقم اثنين ، وثلاثة ، ورقم أربعة ، ورقم خمسة ، قليل النوكليوتيدات بعناية. يجب أن يحتوي البادئات الثاني والخامس على ما لا يقل عن 28 زوجا أساسيا لتتمكن من الركوع بشكل كاف على الحمض النووي الجيني والبادئات. يجب بناء ثلاثة وأربعة باستخدام FRT can FRT يحتوي على البلازميد كقالب ، وتصميم البادئات الثانية والخامسة للسماح بإقران قاعدة تكميلية واسعة النطاق في النهاية الرئيسية الخمسة بين الاشعال الثاني والثالث والبادئات أربعة وخمسة على التوالي.

الآن بالنسبة للجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم قليل النوكليوتيدات الأول والثاني لإعداد أول تفاعلات تفاعلية تفاعلية للتحكم في البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم المنطقة الأولية للمنطقة التجريبية ذات الأهمية المصممة خصيصا. في موازاة ذلك ، قم بإعداد تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني باستخدام قليل النوكليوتيدات ثلاثة وأربعة لتضخيم كاسيت المضادات الحيوية المحيطة ب FRT. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، تم استخدام ترميز جين A PH لمقاومة الكنين.

نفس الوقت ، قم بتضخيم منطقة الحمض النووي النهائي عن طريق تحضير تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثالث باستخدام قليل النوكليوتيدات الخامسة والسادسة والحمض النووي الجيني كقالب. ثم ابدأ تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لجميع العينات الثلاث بعد تنقية جميع شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل الثلاثة ، واستخدم خليطا بكميات متساوية من جميع الأجزاء الثلاثة التي تم الحصول عليها في الجولة الأولى كقالب لإجراء جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). سيتم تحفيز هذا التضخيم بواسطة قليل النوكليوتيدات واحد وستة.

سيكون جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتج بمثابة الحمض النووي المحول في تجارب التحول الطبيعي. بعد زراعة خلايا الكوليرا الخامسة, وسط مخصب هوائية عند 30 درجة مئوية. حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، انقل الثقافة البكتيرية إلى الطائرة الورقية في رقائق واحتضان معلق الخلية طوال الليل عند 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بخلط ما لا يقل عن 200 نانوجرام من الأجزاء المشتقة من تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجولة الثانية في تعليق الخلية البكتيرية. الحرص على عدم فصل البكتيريا على نطاق واسع عن أسطح الكيتين ، ثم احتضان هذا المحلول عند 30 درجة مئوية دون حركة ليوم آخر.

الآن الدوامة ، تنتشر الثقافة بقوة لمدة 30 ثانية على الأقل للبكتيريا التي تؤوي بلازميد PBR القابل للطي من 100 إلى 300 ميكرولتر من محلول الخلية على ألواح انتقائية مزدوجة تحتوي على أمبيسلين. بالإضافة إلى المضاد الحيوي الآخر في الصفائح ، احتضن مزارع الخلايا البكتيرية عند 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات. ثم عزل المحولات المفردة عن الألواح الانتقائية.

ابدأ هذه الخطوة بزراعة البكتيريا على ألواح أجار LB التي تحتوي على أمبيسلين عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. كخطوة اختيارية ، قم بتغيير درجة الحرارة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات إلى 40 درجة مئوية حيث يتم قمع تعبير الوجه من بلازميد PBR flip عند درجات حرارة أعلى. بعد ثماني ساعات أخرى من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، انقل البكتيريا إلى أطباق جديدة.

الآن قم بتقييد المستنسخة بالتوازي مع ألواح أجار المحتوية على المضادات الحيوية والخالية من المضادات الحيوية لاختبار حساسية المضادات الحيوية ثم عزل مستعمرة واحدة حساسة للمضادات الحيوية. ابدأ هذه الخطوة بزراعة المزرعة بين عشية وضحاها في ظل ظروف هوائية عند 30 درجة مئوية ، وتثري الوسط بدون مضادات حيوية. في صباح اليوم التالي ، قم بزراعة ثقافة جديدة لمدة ثلاث إلى ست ساعات عن طريق تخفيف الثقافة الليلية بنسبة واحدة إلى 100 في وسط طازج خال من المضادات الحيوية في خط بعد الظهر أو تخفيف صفيحة المزرعة على ألواح أجار LB عادية ، ثم احتضان الصفائح لمدة ثماني إلى 16 ساعة أخرى عند 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات.

في هذه التجربة الأولى تهدف إلى حذف الجينات المجاورة CTXA و CTXB. تم إنشاء قليل النوكليوتيدات لطريقة الوجه العابر كما أظهرت للتو السلالة الأبوية ، السلالة الوسيطة التي تؤوي كاسيت مقاومة المضادات الحيوية المحيطة ب FRT بدلا من موضع الحمض النووي الأصلي ل C-T-X-A-B والسلالة النهائية المحذوفة ل C-T-X-A-B وتم تحريرها من كاسيت المقاومة تم اختبارها جميعا من أجل النمط الجيني بالجملة PCR تم إجراؤه لهذه التجربة باستخدام الاشعال التي لم تركع على جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل المحول ، ولكن فقط إلى الحمض النووي الكروموسومي. تم فصل شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة الرحلان الكهربائي القياسي لتحديد حجمها.

في الممر الأول ، كانت سلالة الكوليرا من النوع B العالمية موجودة في حجم الشظية المتوقع البالغ 3،143 زوجا أساسيا. في الممر الثاني ، يمكن لجزء تفاعل البوليميراز المتسلسل المشتق من سلالة دلتا C-T-X-A-B-F-R-T. تم تحديد موقع FRT في 3،162 زوجا أساسيا.

وفي الممر الثالث ، تم تحديد موقع جزء Delta CTX A B FFR TP CR عند 1،769 زوجا أساسيا مقارنة بسلم KB الواحد. في المثال الثاني الذي تمت فيه إزالة جزيرة جينومية كاملة ، تم اختيار جزيرة Vibrio Pathogenicity واحدة أو جزيرة VPI واحدة كهدف لهذه التجربة. تم تعديل طريقة الوجه عبر على خطوتين.

أولا ، تم دمج جين مقاومة الكاناميسين بواسطة موقع FRT واحد في بداية PI واحد. ثم تم إجراء جولة ثانية من التحول الطبيعي ، مما سمح بإدخال علامة مقاومة إضافية للمضادات الحيوية ، وهي مقاومة الجنتاميسين متبوعا بموقع FRT ثان في نهاية جزيرة الإمراض. يشار إلى أزواج التمهيدي المعنية فوق كل صورة هلامية واستمرت طريقة FLP العابرة كما هو موضح للتو.

تم التحقق من جميع السلالات الأبوية والمتوسطة والنهائية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي الجيني المنقى في الممر الأول. تم تشغيل جزء PCR من سلالة الكوليرا البرية من النوع V في الممر الثاني. ال [بكر] جزء ينتج من سلالة [فبي] واحدة [فرت] علبة [غم] [فرت] كان ركضت.

وفي الممر الثالث ، تم تحليل سلالة دلتا VPI منتج PCR المشتق من FRT. يشار إلى أزواج التمهيدي فوق كل صورة هلامية. السلالة النهائية تفتقر إلى VPI بالكامل.

في هذا المثال الثالث ، تم دمج تسلسل المحفز المعتمد على بوليميراز الحمض النووي الريبي A T سبعة في المنبع مع ثعلب Gene T ، وهو منظم رئيسي للتحول الطبيعي باستخدام طريقة الوجه العابر مع تعديل طفيف من البروتوكول القياسي. تم تضمين تسلسل إجماع المحفز المعتمد على T سبعة RNA على أنه متدلي في قليل النوكليوتيدات رقم أربعة ورقم خمسة ، بحيث تم الحفاظ على تسلسل الحمض النووي هذا داخل الكروموسوم. حتى بعد استئصال كاسيت مقاومة المضادات الحيوية ، تم دمج الهيكل بعد ذلك في بوليميراز T سبعة RNA يحتوي على سلالة ملونة على شكل حرف V.

في هذه السلالة ، تم دفع التعبير عن جين بوليميراز T سبعة RNA بواسطة محفز LAC UV الخمسة لاختبار التعبير المعتمد على بوليميراز الحمض النووي الريبي T سبعة تم إجراء فحوصات التحول الطبيعي في وسط LB. السلالة الأبوية التي تفتقر إلى المحفز المعتمد على T السبعة الذي يسبق Gene T Fox غير قابلة للتحويل بشكل طبيعي في ظل هذه الظروف بسبب عدم وجود نسخ T FOX في وسط غني وفي غياب المحفز الطبيعي الكيتين. كان هذا النمط الظاهري مستقلا عما إذا كان بوليميراز الحمض النووي الريبي T السبعة قد تم إحداثه بشكل مصطنع بواسطة IPTG أم لا.

ومع ذلك ، فإن السلالة المتولدة عبر الوجه ، والتي تحتوي على المحفز المعتمد على بوليميراز T سبعة RNA في المنبع من الكفاءة Gene T Fox ، كانت بالفعل وسيطا تخصيب قابلا للتحويل بشكل طبيعي بسبب تسرب محفز LAC UV five في وسط LB. قام بوليميراز الحمض النووي الريبي T سبعة المنتج بالفعل بنسخ T FOX من المروج المعتمد على بوليميراز T سبعة RNA بدون تحريض بواسطة IPTG. بدأ هذا الكفاءة الطبيعية والتحول مما يؤكد وظيفة تسلسل المروج المتكامل المعتمد على بوليميراز T سبعة RNA.

تم تعزيز هذا النمط الظاهري بشكل كبير من خلال الحث الكامل لبوليميراز T السبعة RNA بسبب إضافة محفز LAC UV Five IPTG. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التلاعب وراثيا بالكوليرا السادسة باستخدام مزيج من التحول الطبيعي الناجم عن الكيتين وإعادة التركيب القلبي. بمجرد إتقانها ، تسمح لك هذه التقنية بحذف الجينات أو الجزر الجينومية ، وكذلك دمج تسلسل الحمض النووي بطريقة موجهة للموقع في غضون أيام قليلة فقط.