TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا ضمة الكوليرا بناء على التحول الطبيعي وإعادة التركيب، FLP

يهدف هذا الإجراء إلى التعديل الوراثي لبكتيريا vio cray باستخدام هذه الطريقة السريعة والفعالة، والتي تعتمد على التحول الطبيعي وعملية flip recombination. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير مصدر مناسب للكيتين، حيث يعمل الكيتين كمحفز طبيعي لعملية التحول. وفي الخطوة الثانية، يتم إنشاء بنية DNA باستخدام جولتين من تفاعل PCR ومن ثم يتم إجراء التحول الطبيعي، مما يسمح للبكتيريا التي تحتوي على البلازميد PBR flip باستقبال قطعة الـ PCR ودمجها في جينوماتها.

بعد ذلك، يتم استخدام رفع درجة الحرارة لتحفيز إنزيم الليباز المشفر بواسطة البلازميد لإزالة كاسيت مقاومة المضادات الحيوية المحاط بموقع استهداف إعادة التركيب flip أو موقع FRT. وفي الخطوة النهائية، يتم تخليص البكتيريا من البلازميد المشفر لـ FLP. وفي الختام، يُستخدم تفاعل PCR والتسلسل الجيني لإثبات نجاح التلاعب الجيني.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية، مثل استخدام البلازميدات الانتحارية للتلاعب الجيني بـ vire، في أن هذه الطريقة سريعة وفعالة للغاية. ابدأ بوزن عينات تتراوح بين 50 إلى 80 milligram من رقائق الكيتين في أنابيب بلاستيكية قياسية سعة 1.5 milliliter، ثم مع تعريض الأنابيب للأوتوكليف مع ترك الأغطية مفتوحة، وبمجرد انتهاء دورة الأوتوكليف، أغلق الأغطية فوراً وخزن مجموعة الأوتوكليف من الرقائق في درجة حرارة الغرفة. يتطلب الأمر ستة oligonucleotides على الأقل لتضخيم مناطق DNA المستهدفة، بالإضافة إلى كاسيت المضاد الحيوي المحاط بـ FRT عن طريق PCR. كما يُوصى بتضمين زوج من بادئات oligonucleotide خارج قطعة PCR المدرجة.

يتيح ذلك التحقق من التكامل والاستئصال الصحيح لتصميم كاسيت مقاومة المضادات الحيوية المحاط بمواقع FRT، مع مراعاة تصميم قليلة النوكليوتيدات (oligonucleotides) رقم اثنين، وثلاثة، وأربعة، وخمسة. يجب أن تحتوي البادئات 2 و5 على 28 زوجاً قاعدياً على الأقل لتمكينها من الارتباط الكافي بالحمض النووي الجينومي، بينما يجب تصميم البادئتين 3 و4 باستخدام بلازميد يحتوي على موقع FRT كقالب. صمم البادئتين 2 و5 للسماح بتزاوج قاعدي مكمل واسع عند الطرف '5 بين البادئتين 2 و3، وبين البادئتين 4 و5 على التوالي.

الآن، وفي الجولة الأولى من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، استخدم قليلات النوكليوتيد الأولى والثانية لتحضير التفاعل الأول من بين ثلاثة تفاعلات PCR متزامنة ولكنها مستقلة، وذلك لتضخيم المنطقة العلوية من المنطقة التجريبية محل الاهتمام في البنى المصممة خصيصاً. وبالتوازي مع ذلك، قم بتحضير تفاعل PCR الثاني باستخدام قليلات النوكليوتيد الثالثة والرابعة لتضخيم كاسيت المضاد الحيوي المحاط بمواقع FRT. على سبيل المثال، في هذه التجربة، تم استخدام جين A PH الذي يشفر مقاومة الكاناميسين.

قم بتضخيم منطقة DNA المصب بالتزامن من خلال تحضير تفاعل PCR الثالث باستخدام قليل النوكليوتيدات الخامس والسادس والحمض النووي الجينومي كقالب. بعد ذلك، ابدأ تفاعل PCR لجميع العينات الثلاث، وبعد تنقية جميع شظايا PCR الثلاث، استخدم خليطاً يحتوي على كميات متساوية من الشظايا الثلاث التي تم الحصول عليها في الجولة الأولى كقالب لإجراء جولة ثانية من PCR. سيتم تحفيز هذا التضخيم بواسطة قليل النوكليوتيدات الأول والسادس.

ستعمل قطعة PCR الناتجة كـ DNA مُحوِّل في تجارب التحول الطبيعي. بعد تنمية خلايا v cholera في وسط غني هوائي عند 30 degrees Celsius، يتم حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، يتم نقل المزرعة البكتيرية إلى الكيتين الرقائقي وتحضين معلق الخلايا طوال الليل عند 30 degrees Celsius. بعد ذلك، اخلط بعناية ما لا يقل عن 200 nanograms من الشظايا الناتجة عن جولة الـ PCR الثانية في معلق الخلايا البكتيرية. ومع الحرص على عدم فصل البكتيريا بشكل كبير عن أسطح الكيتين، يتم تحضين هذا المحلول عند 30 degrees Celsius دون تحريك لمدة يوم آخر.

الآن، قم برجّ المزرعة بجهاز vortex بقوة لمدة 30 ثانية على الأقل؛ وبالنسبة للبكتيريا التي تحمل بلازميد PBR flip، وزع من 100 إلى 300 µL من محلول الخلايا على أطباق اختيار مزدوجة تحتوي على ampicillin، بالإضافة إلى المضاد الحيوي الآخر الموجود في الأطباق. قم بتحضين مزارع الخلايا البكتيرية عند درجة حرارة 30 °C حتى تظهر المستعمرات. ثم قم بعزل المحولات المنفردة من أطباق الاختيار.

ابدأ هذه الخطوة بتنمية البكتيريا على أطباق أغار LB تحتوي على الأمبيسيلين عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. كخطوة اختيارية، قم بتغيير درجة الحرارة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات إلى 40 درجة مئوية، حيث يتم إلغاء كبت تعبير flip من بلازميد PBR flip عند درجات الحرارة المرتفعة. بعد ثماني ساعات إضافية من الحضن عند 37 درجة مئوية، انقل البكتيريا إلى أطباق جديدة.

قم الآن بتقييد المستنسخات بالتوازي على أطباق أغار تحتوي على مضاد حيوي وأخرى خالية منه لاختبار الحساسية للمضاد الحيوي، ثم اعزل مستعمرة واحدة ناتجة حساسة للمضاد الحيوي. ابدأ هذه الخطوة بتنمية المزرعة طوال الليل تحت ظروف هوائية عند 30 درجة مئوية، في وسط إغناء خالٍ من المضادات الحيوية. وفي صباح اليوم التالي، قم بتنمية مزرعة جديدة لمدة تتراوح من ثلاث إلى ست ساعات عن طريق تخفيف مزرعة الليلة الماضية بنسبة 1 إلى 100 في وسط جديد خالٍ من المضادات الحيوية، وفي فترة ما بعد الظهيرة، قم بتخطيط أو صب تخفيف المزرعة على أطباق أغار LB عادية، ثم حضن الأطباق لمدة تتراوح من ثماني إلى 16 ساعة أخرى عند 30 درجة مئوية حتى تصبح المستعمرات مرئية.

في هذه التجربة الأولى التي تهدف إلى حذف الجينات المجاورة CTXA و CTXB، تم تخليق قليلات النوكليوتيد (oligonucleotides) الخاصة بطريقة trans flip. وقد تم اختبار السلالة الأبوية، والسلالة الوسيطة التي تحمل كاسيت مقاومة للمضادات الحيوية محاطاً بمواقع FRT بدلاً من الموقع الأصلي للحمض النووي C-T-X-A-B، والسلالة النهائية التي تم فيها حذف C-T-X-A-B وتحررت من كاسيت المقاومة، وذلك للتحقق من تركيبها الجيني. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الشامل لهذه التجربة باستخدام بادئات (primers) لا ترتبط بقطعة PCR التحويلية، بل ترتبط فقط بالحمض النووي الكروموسومي. ثم تم فصل قطع PCR عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز القياسي لتحديد أحجامها.

في المسار الأول، ظهرت سلالة الكوليرا العالمية من النوع B عند حجم القطعة المتوقع وهو 3, 143 base pairs. وفي المسار الثاني، ظهرت قطعة PCR المشتقة من السلالة delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT عند 3, 162 base pairs.

وفي المسار الثالث، تَم تحديد موقع قطعة delta ctx A B FFR TP CR عند 1,769 base pairs مقارنةً بسلم 1 KB. وفي المثال الثاني الذي تَم فيه إزالة جزيرة جينومية كاملة، اختيرت جزيرة Vibrio Pathogenicity island one أو VPI one لتكون الهدف في هذه التجربة. وقد تَم تعديل طريقة trans flip في خطوتين.

أولاً، تمت عملية دمج جين مقاومة الكاناميسين (kanamycin) مسبوقة بموقع FRT واحد في بداية جزيرة الإمراض (PI) الأولى. بعد ذلك، تم إجراء جولة ثانية من التحول الطبيعي، مما سمح بإدراج علامة مقاومة مضاد حيوي إضافية، وهي مقاومة الجنتاميسين (Gentamycin)، متبوعة بموقع FRT ثانٍ في نهاية جزيرة الإمراض. وقد تم توضيح أزواج البادئات المقابلة فوق كل صورة لهلام الكهربائي، واستُكملت طريقة trans FLP كما تم توضيحها للتو.

تم التحقق من السلالات الأبوية والوسطية والنهائية جميعاً عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للحمض النووي الجينومي المُنقّى في المسار الأول. وتم تشغيل قطعة الـ PCR الخاصة بسلالة V cholera من النوع البري في المسار الثاني. كما تم تشغيل قطعة الـ PCR الناتجة عن السلالة VPI one FRT can GM FRT.

وفي المسار الثالث، تم تحليل ناتج PCR المشتق من السلالة delta VPI one FRT. وقد أشير إلى أزواج البادئات فوق كل صورة للهلام. تفتقر السلالة النهائية إلى VPI one بالكامل.

في هذا المثال الثالث، تم دمج تسلسل محفز معتمد على بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 في الجزء العلوي من الجين T fox، وهو منظم رئيسي للتحول الطبيعي، وذلك باستخدام طريقة trans flip مع تعديل بسيط على البروتوكول القياسي. وقد أُدرج تسلسل الإجماع للمحفز المعتمد على بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 كبروزات في قليلات النوكليوتيد رقم أربعة ورقم خمسة، بحيث يتم الحفاظ على تسلسل DNA هذا داخل الكروموسوم. وبعد استئصال كاسيت مقاومة المضادات الحيوية، دُمج التركيب بعد ذلك في سلالة V colorized تحتوي على بوليميراز الحمض النووي الريبي T7.

في هذه السلالة، تم توجيه التعبير عن جين T7 RNA polymerase بواسطة محفز LAC UV5 لاختبار التعبير عن T Fox المعتمد على T7 RNA polymerase. أُجريت فحوصات التحول الطبيعي في وسط LB. إن السلالة الأصلية التي تفتقر إلى المحفز المعتمد على T7 الذي يسبق جين T Fox غير قابلة للتحول طبيعياً في ظل هذه الظروف، وذلك بسبب غياب نسخ T FOX في الوسط الغني وفي غياب محفزه الطبيعي الكيتين. وكان هذا النمط الظاهري مستقلاً عما إذا كان T7 RNA polymerase قد تم تحفيزه اصطناعياً بواسطة IPTG أم لا.

ومع ذلك، فإن السلالة الناتجة عن عملية trans flip، والتي تحتوي على محفز T7 RNA polymerase dependent في المنبع من جين الكفاءة T Fox، كانت بالفعل قابلة للتحول الطبيعي في الوسط الغني بسبب تسرب المحفز LAC UV five في وسط LB. حيث قام T7 RNA polymerase المُنتج بنسخ T FOX بالفعل من محفز T7 RNA polymerase dependent دون الحاجة إلى الحث بواسطة IPTG. وقد أدى ذلك إلى بدء الكفاءة الطبيعية والتحول، مما يؤكد فاعلية تسلسل محفز T7 RNA polymerase dependent المُدمج.

وقد تعزز هذا النمط الظاهري بشكل ملحوظ من خلال الحث الكامل لإنزيم T seven RNA polymerase نتيجة إضافة IPTG، وهو المحفز للمروج LAC UV five. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التلاعب الجيني ببكتيريا VI cholera باستخدام مزيج من التحول الطبيعي المستحث بالكيتين وإعادة التركيب بتقنية flip. وبمجرد إتقان هذه التقنية، ستتمكن من حذف الجينات أو الجزر الجينومية، بالإضافة إلى دمج تسلسلات DNA بطريقة موجهة لموقع محدد في غضون أيام قليلة فقط.