دراسة حاجز الميتوزى بواسطة يوضح الحيوي Kinetochore السلوك البروتين والحركة كروموسوم في المعيشة

يهدف هذا الاختبار إلى توضيح كيفية تصور ديناميكيات البروتين وأنماط تموضعه داخل الجسم الحي في أجنة ذبابة الفاكهة (drosophila) الحية باستخدام المجهر البؤري بنظام التصوير الزمني. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع الأجنة من سلالات drosophila المحفوظة. بعد ذلك، تُنقل الأجنة إلى شريحة، ثم تُزال القشور يدوياً من الأجنة لتحويلها إلى أجنة مطلية.

يتم تثبيت A لاحقاً بطريقة منظمة على شرائح مُعدة مسبقاً، وبناءً على التجربة، قد يتم حقنها مجهرياً بكواشف مناسبة لتحفيز نقطة تفتيش المغزل. تتمثل الخطوة النهائية في هذا الإجراء في إجراء تصوير بالفاصل الزمني للأجنة باستخدام المجهر البؤري. وفي النهاية، يُستخدم التصوير بالفاصل الزمني والمجهر البؤري لإظهار بروتين نقطة تفتيش المغزل، والتوضع المشترك لسلوكيات الكروموسومات، وتأثير العوامل المحفزة لنقطة التفتيش في خطوط oph المعدلة وراثياً والمتعلقة بنقطة التفتيش.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تنظيم ME، مثل تأثير الطفرات أو عمليات الحذف لبروتين نقطة تفتيش المغزل من خلال استخدام الخطوط الجينية على التوضع المشترك لمكونات نقطة التفتيش الأخرى، ونتيجة ذلك على قدرة نقطة تفتيش تجميع المغزل على العمل بكفاءة. يتم الحفاظ على الذباب المعدل وراثياً عند درجة حرارة 25 °C في قوارير بلاستيكية تحتوي على غذاء الذباب، مع إضافة مسحوق خميرة جاف على السطح. يتم استبدال القارورة بشكل روتيني كل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، وذلك اعتماداً على ظروف النمو.

لتحضير غذاء الذباب، قم بتسخين كمية مناسبة من خليط غذاء الذباب مع التقليب المستمر لإذابة المكونات باستخدام مضخة تمعجية، ثم وزع من 8 إلى 10 milliliters من هذا الوسط في شكل ملاط داخل كل أنبوب بلاستيكي. عندما يتصلب ملاط الغذاء ويبرد إلى درجة حرارة الغرفة، أغلق كل أنبوب بسدادة من رغوة القطن. ضع أنابيب الغذاء هذه في صينية، وأغلقها في كيس بلاستيكي، واحفظها عند درجة حرارة 4 °C لجمع البيض على نطاق صغير.

انقل حوالي 50 زوجاً من الذباب البالغ بعمر يومين إلى ثلاثة أيام إلى قارورة غذاء ذباب جديدة تحتوي على مسحوق خميرة جاف إضافي على سطحها لوضع الأجنة. يتم التحضين عند 25 °C، وهي في هذه الحالة درجة الحرارة التي يتم الحفاظ عليها بواسطة تكييف الهواء في الغرفة. كل ساعة، انقل الذباب إلى قارورة جديدة واترك الأجنة لمدة 30 دقيقة.

لضمان أن تكون بعض الأجنة التي تم جمعها في مرحلة تتراوح بين دورة الانقسام النووي الثامنة والعاشرة، يتم عادةً التخلص من مجموعة الساعة الأولى لأنها غالباً ما تحتوي على أجنة هرمة كانت محتجزة في أجسام الإناث عندما لم تكن الظروف مناسبة لوضع البيض. وبناءً على ذلك، سيتم استخدام الأجنة التي تم نقلها من الساعة الثانية فصاعداً فقط في هذه التجارب.

تُستخدم شرائح المجهر وأغطية شرائح بمقاس 50 في 22 مليمتر لهذا الإجراء. ابدأ بأخذ غطاء شريحة، وباستخدام فرشاة قلم دقيقة ورطبة، بلل الزوايا الأربع على أحد الجانبين قليلاً بكمية صغيرة جداً من الماء. ضع غطاء الشريحة على شريحة المجهر.

يجب أن يمنع التوتر السطحي الشعري الناتج عن الغشاء السائل الرقيق غطاء الشريحة من التحرك. ضع شريطاً رفيعاً من غراء الهبتان عبر منتصف غطاء الشريحة. يجب أن يتبخر الهبتان في غضون ثوانٍ، تاركاً الغراء على غطاء الشريحة.

بعد ذلك، استخدم قلم الماس لقص شريحة غطاء أخرى إلى مربعات صغيرة تبلغ مساحتها حوالي 1.5 مليمتر مربع. التقط مربعاً واحداً وضعه على أحد طرفي شريط الغراء. سيُستخدم هذا المربع لفتح طرف الإبرة عند الحاجة إلى الحقن المجهري.

خذ شريحة مجهرية أخرى وألصق عليها قطعة من الشريط اللاصق ذو الوجهين بطول سنتيمترين، ثم انزع الورقة الغطائية لبدء إجراء طلاء الأجنة. انقل الذباب إلى قارورة غذاء جديدة باستخدام فرشاة دقيقة ورطبة. انقل حوالي 50 بيضة إلى الشريط اللاصق ذو الوجهين الموجود على الشريحة المجهزة.

استخدم كمية مناسبة من السائل للسماح بتوزيع البويضات. عندما يتبخر السائل، ستلتصق البويضات بالشريط اللاصق تحت مجهر تشريحي. المس البويضات برفق عدة مرات على طول محورها الطولي باستخدام الجانب الخارجي لأحد طرفي ملقط حتى ينكسر غشاء Corian وينفتح.

اترك الجنين في غلاف Corian لمنع الجفاف السريع. استمر في هذه العملية حتى يتم معالجة من 10 إلى 20 من البيض. بعد ذلك، التقط الأجنة وأخرجها من غلاف Corian واحدة تلو الأخرى وضع الأجنة برفق في شريط رأسي.

على شريط الغراء. قم بمحاذاة الأجنة بحيث يكون الجانب الطولي لها موازياً وباتجاه معاكس للجانب الطولي لشريط الغراء. ضع الأجنة في غرفة تجفيف لمدة تتراوح من ثلاث إلى ثماني دقائق.

أخيرًا، قم بتغطية الأجنة بكمية مناسبة من زيت Paraffin لمنع الجفاف المفرط قبل عملية الحقن المجهري. يُعد الحقن المجهري من أصعب جوانب هذا الإجراء. ولجعل عملية الحقن المجهري سهلة وفعالة قدر الإمكان، يجب اتباع البروتوكول المحدد لتحضير الشريحة.

يجب تحضير الأجنة بعناية بحيث تكون في حالة مثالية للحقن المجهري. يتم تجهيز الإبر المخصصة لحقن الأجنة مجهرياً مسبقاً. وباستخدام طرف تحميل دقيق، يتم ملء الإبرة من الخلف بمقدار 1 إلى 2 µL من الكاشف بتركيز مناسب في محلول الحقن المنظم.

قم بتثبيت الإبرة في حامل الإبر على مجهر Leica TCSP two confocal المقلوب مع توصيل أنبوب الضغط بنظام التحكم في الحقن. حدد موقع الجنين تحت العدسة الشيئية بقوة تكبير 40 مرة. بعد ذلك، حدد موقع ظل الإبرة دون تغيير المستوى البؤري.

يتم تحقيق ذلك عن طريق تحريك الإبرة إلى مركز مجال الرؤية وخفضها تدريجياً إلى المستوى البؤري الأيمن. حرك منصة المجهر برفق شديد للعثور على المربع الصغير من غطاء الشريحة المثبت مسبقاً عند أحد طرفي شريط الغراء. حرك طرف الإبرة برفق شديد حتى يصطدم بحافة غطاء الشريحة المربع الصغير ويكسره بلطف.

حرك المنصة حتى تعود الأجنة إلى مجال الرؤية، ثم اختر جنيناً في العمر المناسب للحقن. حرك الجنين بعناية ليقترب من الإبرة، وأعد ضبط المستوى البؤري لكل من الجنين والإبرة. حرك الجنين ليدخل في الإبرة.

احقن قطرة من الكاشف في جانب الجنين ثم حرك الجنين بعيداً. يتم جمع صور الفاصل الزمني أو صور مفردة للأجنة الحية باستخدام نظام المجهر البؤري المقلوب Leica TCSS SP two مع عدسة شيئية غمر زيتية بقوة 40 مرة. عند تصوير عدة فلوروفورات ذات أطياف متداخلة ويتم التعبير عنها بشكل مشترك في نفس الجنين، يتم جمع كل طول موجي لانبعاث البروتين الفلوري بالتتابع.

ظهرت الصور لاحقًا عند تحديد الأطر الزمنية للتصوير بفاصل زمني. ويجب مراعاة هذه العوامل. وعادةً ما يتم الحصول على صورة واحدة كمتوسط لخطين من المسح.

بمتوسط مسح لإطارين، يستغرق مسح صورة بحجم 512 في 512 بكسل ما لا يقل عن 6.3 ثانية في وضع المسح المتزامن و15.44 ثانية في وضع المسح التسلسلي لإنتاج نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة. يتم ضبط الثقب عادةً على 1 إلى 2 au أو وحدة إيري، ويتم تعديل قدرة الليزر إلى أدنى مستوى ممكن لتجنب أي تبييض ضوئي ملحوظ. يوضح هذا الفيلم التمثيلي بنظام الفاصل الزمني التجنيد الحركي الديناميكي لـ CDC 20 وحركة الكروموسومات في أجنة ophs in cial الحية.

تم التقاط صور بنظام الفاصل الزمني (Time-lapse) لجنين أولي معدل وراثياً يعبر بشكل مشترك عن G-F-P-C-D-C 20، والذي يظهر باللون الأخضر، و RFP his stone two B الذي يظهر باللون الأحمر. خلال دورات الانقسام النووي، تم التقاط سبعة إلى ثماني إطارات كل 10 ثوانٍ، واعتُبر الإطار الذي تكون فيه الخلايا في الطور التمهيدي (prophase) نقطة الزمن صفر. يوضح هذا الشكل الإطارات المأخوذة من فيلم الفاصل الزمني، حيث يمكن ملاحظة G fp CDC 20 بسهولة في الحيز الحركي (kinetochore) خلال الطور التمهيدي والطور التمهيدي الاستوائي (prometaphase)، كما تشير الأسهم البيضاء في الصورتين الثالثة والرابعة على التوالي، ويستمر وجوده في الحيز الحركي خلال الطور الاستوائي (metaphase) والطور الانفصالي (anaphase) كما هو ملاحظ في الصورتين الخامسة والسادسة على التوالي.

يُستبعد G-F-P-C-D-C 20 من النواة البينية الموضحة برأس السهم الأبيض في الصورة الأولى، ثم يدخل النواة في بداية الطور التمهيدي كما يظهر في الصورة الثانية. وفي الصور من 8 إلى 14، تم تحديد أشكال الكروماتين باستخدام RFP histone two B المعبر عنه بشكل مشترك كعلامات مدمجة. وتظهر الصور في الصف السفلي.

باستخدام هذا البروتوكول، يمكن دراسة وظائف نقطة تفتيش تجميع المغزل (spindle assembly checkpoint) أو الـ SAC عن طريق معالجة الأجنة عبر الحقن المجهري للأجسام المضادة، أو البروتينات الموصومة فلورياً، أو المركبات الكيميائية ذات الصلة التي قد تحفز الـ SAC. في هذا المثال، تُعالج الأجنة باستخدام colchicine لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة، مما يؤدي إلى تحفيز الـ SACG FP CDC 20، أو GFP MAD. وقد استُخدمت إشارتان حركيتان أساسيتان كعلامات لتطور الدورة الخلوية.

في اللوحة العلوية، تشير ARES إلى الكروموسومات المتوقفة في الصور من الثانية إلى السادسة. تشير المنطقة المحددة بسهم في الصورة الأولى إلى الحالة قبل المعالجة بالكولشيسين، حيث يتم استبعاد G-F-P-C-D-C 20 من نواة الطور البيني المتأخر. وتظهر الصور في اللوحة الوسطى أنه في حالة غياب MAD two الداخلي، يستمر G-F-P-C-D-C 20 الموضح بالأسهم في الصور من السابعة إلى الثانية عشرة في التذبذب دخولاً وخروجاً من النواة، وبشكل متقطع على المسار الحركي.

على الرغم من أن عملية انقسام السيتوبلازم تبدو معيبة، فإن هذا يشير إلى فشل في وظيفة نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC) في إيقاف الخلايا استجابةً للمعالجة بالكولشيسين (Colchicine). ويظهر مثال على فشل انفصال النواة البنت في الصورة 10. وأخيرًا، في اللوحة السفلية، تشير رؤوس السهام في الصور من 14 إلى 18 إلى نوى حركية ساكنة تراكمت فيها بروتينات GFP MA two الاندماجية، مما يشير إلى أن بروتين GFP MA two الوظيفي يعالج النمط الظاهري لعيب الـ SAC في جنين طفرة MA two.

يشير رأس السهم في الصورة 13 إلى تراكم GFP MAD 2 في نواة في مرحلة متأخرة من الطور البيني. بعد مشاهدة هذه الفيديوهات، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حصاد أجنة software two من السيقان التي يتم الحفاظ عليها، وفصل الأجنة يدويًا قبل تحضير الشرائح للحقن المجهري وإجراء التصوير الزمني الحي باستخدام المجهر البؤري.