أسلوب مبسط لل

نستعرض اليوم تقنية مبسطة لاستئصال القرنية وأنسجة الشبكية من مقلة عين بشرية لمتبرعين متوفين. ستساعد التقنية الموصوفة في استخلاص أنسجة عالية الجودة لاستخدامها في أغراض الزراعة، والجراحة، والأبحاث، دون إتلاف الأنسجة الأخرى في مقلة العين. وبفضل خبرتنا الممتدة لـ 18 عاماً وإجراء عمليات زراعة قرنية عديدة كل عام، حافظنا على معايير جودة عملنا من خلال تطوير تقنيات جديدة وتحسين مهاراتنا يومياً.

لتحقيق ذلك، نقوم باستئصال القرنية أولاً، يليه استئصال الشبكية. تُعد القرنية نسيجاً غير وعائي يسمح بنفاذ الضوء إلى الشبكية، ولهذا الغرض، يجب أن تحافظ دائماً على درجة جيدة من الشفافية. تتكون القرنية من خمس طبقات، وهي الظهارة، وطبقة بومان، والسدى، وغشاء ديسميت، والبطانة.

إذا تضررت القرنية، يمكن استبدالها بمساعدة قرنية مانحة مناسبة. وتُعد المشيمية الغشاء المتوسط بين الصلبة والشبكية، ويحدها من الداخل غشاء بروس، وهي المسؤولة عن تدفق الدم في العين. ويُعتبر الاستئصال المناسب للمشيمية بأهمية إزالة الشبكية.

تساعد الشبكية في استقبال الضوء القادم من القرنية والعدسة وتحويله إلى طاقة كيميائية تُنقل في النهاية إلى الدماغ. وبمساعدة العصب البصري، وبما أنها شفافة ورقيقة، يجب استئصالها بشكل منهجي لضمان جودة الأنسجة. قم بتشغيل خزانة التدفق الهوائي الصفائحي.

نظف غطاء التدفق الصفائحي باستخدام كحول الإيزوبروبانول بتركيز 70%. ارتدِ ملابس الوقاية الشخصية مثل غطاء الرأس الجراحي، والقفازات المعقمة، وأكمام الواقية. وباستخدام التقنية التعقيمية، قم بإعداد المجال المعقم عن طريق وضع منشفة معقمة وصينية أدوات معقمة مسبقاً.

افتح عبوة الأدوات المعقمة بطريقة معقمة واقلب محتوياتها على المجال المعقم، مع تجنب أي تلوث. قم بتوزيع جميع المواد والأدوات المعقمة في المجال المعقم، وضع أوعية العيون التي تحتوي على مقل العيون بحيث تكون بعيدة عن حافة المجال المعقم. ولتسهيل الاستخدام، ضع ملصقات على الزجاجات التي تحتوي على وسط تخزين مُعد مسبقاً، وضع غطاء iodine polyol pyro على sodium th sulfate، ومحلول sterile phosphate buffer saline.

خارج منطقة التغذية المعقمة، اترك الأنسجة والمحاليل العينية لتصل إلى درجة حرارة الغرفة العادية، حيث يتم حفظها في الثلاجات عند درجة حرارة 4 °C. تجنب تكرار دورات التسخين أو التبريد. قم بإزالة الشاش والإسفنج من وعاء العين باستخدام ملاقط معقمة.

ضع مقلة العين على الغطاء وأزل الضمادات الإضافية. ارفع مقلة العين بعناية مع العصب البصري واغمر المقلة في محلول IPVP المعقم. قم بتطهير مقلات العين في محلول IPVP المعقم لمدة دقيقتين.

انقل مقلة العين إلى محلول ثيوسلفات الصوديوم المعقم لمدة دقيقة واحدة. ثم انقل المقابل إلى محلول منظم الفوسفات المعقم المخصص لخطوط الخلايا واتركها حتى يحين وقت التشغيل. وبالعمل تحت غطاء التدفق الهوائي الصفائحي، اغسل مقلة العين وأخرجها من محلول PBS وضعها ضمن المجال المعقم.

قم بتغليف مقلة العين باستخدام شاش معقم، مع ترك القرنية وحوالي خمسة مليمترات من الصلبة المحيطة بالقرنية مكشوفة؛ ويمكن ببساطة إمساك مقلة العين باليد. مع الحفاظ على ضغط مناسب باستخدام مقص معقم، قم بإزالة جميع البقايا المحتملة للملتحمة دون إتلاف القرنية.

استخدم شفرة مشرط تستخدم لمرة واحدة لإجراء شق في الصلبة بطول ثلاثة إلى أربعة مليمترات من منطقة الليمبوس. بعد ذلك، قم بتوسيع الشق بزاوية 360 درجة، مع تجنب ثقب نسيج العنبية الموجود تحته أو التسبب في أي تشويه لانحناء القرنية الطبيعي؛ قم بإجراء أربعة شقوق كبيرة مع ترك أربع فجوات صغيرة، وذلك لتجنب خروج الجسم الزجاجي.

يتم قص الفجوات الأربع جميعها، مع ضمان عدم إزالة أي أنسجة أخرى. قد تعيق وجود لويحات صلبيّة صغيرة عملية القص، لذا يجب التأكد من إتمام استئصال الصلبة باستخدام مقص الجراحة المجهرية. ينبغي إجراء هذه العملية دون إتلاف المشيمية والشبكية والجسم الزجاجي.

افحص الشق للتأكد من اكتماله. إذا تم إجراء الشق بشكل صحيح، فإن الحافة الصلبية القرنية تلتصق بالجسم الهدبي فقط عند النقطة المقابلة للقرنية، ثم ضع المقلة العينية بالقرب من مركز الحقل المعقم. أتمم عملية إزالة القرنية باستخدام ملاقط معقمة.

ثبّت الحافة الصلبانية في مكانها واستأصل القرنية مع الحافة الصلبانية بعيداً عن توهج العين. افصل بلطف أي أنسجة مجاورة متبقية عن الزر القرني الصلباني. لا تسحب الحافة القرنية الصلبانية أبداً بطريقة قد تسبب توتراً عبر القرنية، ولا تسمح لها بالسقوط مرة أخرى على الغرفة الأمامية.

يتم فحص كثافة الخلايا البطانية للقرنية باستخدام محلول منخفض التوتر، كما يتم فحص موت الخلايا باستخدام صبغتي Trip وBlue لمدة دقيقة واحدة تقريباً. قم بإزالة صبغتي Trip وBlue باستخدام شاش سلكي معقم واغسل القرنية في محلول PBS معقم. ثم انقلها إلى طبق بتري معقم مملوء بمحلول السكروز.

يساعد هذا المحلول في تهيئة بيئة منخفضة التوتر، كما يساعد في تحديد الخلايا بصرياً. ثم تُعد الخلايا تحت مجهر ضوئي بقوة تكبير 100x، وتُقاس كعدد الخلايا لكل مليمتر مربع. وعادةً ما يتم فحص الخلايا من حيث الكثافة الخلوية والسمات المورفولوجية مثل الحدود بين الخلوية، وتعدد الأشكال، والتحلل، والضمور، وموت الخلايا.

يعد سُمك القرنية أيضاً سمة مهمة لعملية الزرع، جنباً إلى جنب مع معدل شفافية جيد للقرنية المستأصلة. يُستخدم ملقط القرنية (CLO) المعقم لتثبيت القرنية عند الحافة الصلبية، ثم يُثنى ملقط القرنية لضمان فتحة ثقب كافية لإغلاق الحافة الصلبية، ويتم نقل الحافة الصلبية للقرنية باستخدام ملقط قرنية إلى وسط تخزين القرنية الذي تم تحضيره مسبقاً في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يجب حفظ القرنية عند 31 درجة SIUs خلال فترة حفظ القرنية التي تستمر لمدة أربعة أسابيع.

تخضع وسائط التخزين لعدة اختبارات ميكروبيولوجية باستخدام جهاز B 9 2 4 0. وبما أن القرنية تصبح أكثر سمكاً من حجمها المعتاد المطلوب لعملية الزرع أثناء التخزين، تستخدم بنوك العيون عوامل تقليل التورم؛ حيث يُستخدم 6%Dextron T 500 لإعادة القرنية إلى حجمها الطبيعي ووسط النقل.

نظف الأدوات المعقمة باستخدام محلول إزالة الـ RNA لتهيئة بيئة خالية من الـ RNA قبل استئصال الشبكية. جهز المجال المعقم وتأكد من أن مقلة العين سليمة، مع إزالة القرنية وحافة الصلبة فقط. إذا تسرب الجسم الزجاجي، فسيصعب استئصال أنسجة الشبكية.

إذا كان عمر المتبرع أقل من 65 عاماً، يتم حفظ الصلبة في كحول بتركيز 70% لأغراض جراحية بعد إجراء الاختبارات المصلية. وفي هذه الحالات، لا يتم قطع الصلبة، بل يُزال الجسم الزجاجي فقط وتُحفظ الصلبة بأكملها من أجل استئصال الشبكية. ابدأ بعمل قطع أو شق صغير بالقرب من الجانب القرني للصلبة، ثم تحرك باتجاه العصب البصري باستخدام ملاقط ومقصات معقمة.

أمسك جزءاً من الصلبة باستخدام ملقط معقم وقم بالقص بالمقص في اتجاه العصب البصري تدريجياً، مع تجنب إتلاف الجسم الزجاجي. يجب فصل السدادات المشيمية عن الصلبة نظراً لالتصاقهما معاً. قم بقص الصلبة بالكامل للكشف عن نسيج المشيمية. ماذا؟

بمجرد قطع الصلبة تماماً، افصل الصلبة عن الأنسجة المتبقية عن طريق قطعها بالقرب من العصب البصري، وستظهر الآن طبقة كاملة من المشيمية تغطي الجسم الزجاجي. املأ هذه الأنابيب الملحقة الخالية من RNA والمعقمة بـ 2 ml من محلول رينجر لاكتات (RL) باستخدام ملقطين معقمين. قم بإزالة طبقة المشيمية برفق عن طريق الإمساك بالعصب البصري بزوج واحد من الملاقط وإزالة المشيمية بالزوج الآخر.

افصل المشيمية جزئياً واقطعها لتسهيل عملية الإزالة. يمكن قطع طبقة المشيمية باستخدام المقص مع تجنب إلحاق أضرار بالشبكية. ضع طبقة المشيمية المستأصلة داخل محلول RNA later واحفظها في درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة.

قم بإزالة كل المشيمية الإضافية للكشف عن نسيج الشبكية. وبمجرد إزالة طبقة المشيمية بأكملها، ستظهر طبقة شفافة من الشبكية. ومن الواضح أن طبقة المشيمية تحتوي على غشاء بروش الداخلي، والذي يمكن إزالته أيضاً، ولكن من الصعب تمييزه بالعين المجردة.

وبالمثل، استخدم ملقطين لإزالة طبقة الشبكية. ومن السهل عزل كمية كبيرة من الشبكية إذا تم الاستئصال بالقرب من العصب البصري. يمكن الآن رؤية جميع طبقات العين.

ضع الشبكية المستأصلة داخل محلول RNA later واحفظها في درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. نظف منطقة العمل باستخدام كحول Isopropyl 70%. يمكن فحص الخلايا البطانية المصبوغة باستخدام trypan blue تحت تكبير 100x باستخدام مجهر مقلوب.

عادةً ما يتم حفظ القرنية المناسبة التي تحتوي على أكثر من 200 خلية لكل مليمتر مربع لاستخدامها لاحقاً. ويساعد تصنيف جودتها من "مقبولة" إلى "ممتازة" في إجراء الدراسات المقارنة. وبمجرد أن تصبح القرنية جاهزة للزراعة، يتم تدوين سمكها ودرجة شفافيتها، ثم تُستخدم القرنية المناسبة في عملية زراعة القرنية النافذة حيث تُنقل القرنية بالكامل.

يتم التحقق من موت الخلايا عن طريق رصد الخلايا المصبوغة باللون الأزرق، ويتم تقييم ذلك كنسبة مئوية للخلايا الميتة. وتُعتبر نسبة موت الخلايا الإجمالية التي تتجاوز 2% غير مناسبة أثناء عملية الحفظ. أما إذا كانت كثافة الخلايا أقل من 2200 خلية لكل مليمتر مربع أو كان هناك تلف ناتج عن موت الخلايا، فيمكن استخدام القرنية في عمليات زراعة الطبقة الأمامية من القرنية.

إذا كانت الصدمة الأمامية تالفة وكانت القرنية تتمتع بكثافة جيدة للخلايا البطانية، فيمكن استخدام القرنية في عملية زراعة الطبقة الخلفية للقرنية. عادةً ما يزداد سمك القرنية أثناء زراعة العضو، ويساعد وسط النقل في استعادة شكلها وبنيتها الطبيعيين.

علاوة على ذلك، تساعد زراعة الأعضاء في إعادة طلائية القرنية، ونظراً لطول فترة التخزين، فإنها تساعد في الاختيار المناسب للمتبرع. وإجراء الاختبارات الميكروبيولوجية والمصلية. كما أنها تمنح وقتاً كافياً لترتيب الجراحة وتساعد في فحص كثافة الخلايا البطانية وشكلها عندما يتعذر ذلك بسبب طول الفترة الزمنية بعد الوفاة.

وبالتالي، إذا تم اتباع الإجراء كما هو موصوف، يمكن استئصال القرنيات دون إلحاق أي ضرر بالأنسجة الأخرى. وفي حال كانت القرنية غير مناسبة للزراعة، يمكن استخدامها لأغراض بحثية لتطوير أوساط ومواد حفظ جديدة لدراسة أمراض سطح العين، وعزل الخلايا الجذعية الحوفية، ودراسة تأثير الأدوية على القرنية. أما بالنسبة للشبكية، فيمكننا تجنب التلوث الخلطي لعينات RNA بأنسجة أخرى والحفاظ على سلامة RNA، وهو أمر ذو أهمية جوهرية.

تُعد هذه الأنسجة ضرورية لأغراض البحث العلمي، حيث تهدف إلى توصيف النسخ الوراتي (transcriptome) للأنسجة العينية، وعزل الخلايا الجذعية لمشاريع الطب التجديدي، وتقييم الاختلافات النسيجية بين أنسجة الأشخاص الطبيعيين أو المصابين. وبمجرد إزالة نسيج الشبكية، يمكن استخدامه لأغراض مختلفة، وبالتالي قد تختلف الخطوات وظروف الحفظ اللاحقة وفقاً لذلك. فعلى سبيل المثال، يمكن وضع نسيج الشبكية في أنابيب تحتوي على كواشف تثبيت RNA مثل r nator أو محلول thisis buffer لاستخلاص RNA أو DNA، أو استخدام displaced أو trypsin لعزل الخلايا.

تثبيت المحاليل قبل دمج الأنسجة في البارافين أو مركب OCT لإجراء الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي. شكراً لمشاهدة هذا الفيديو ونتمنى لك التوفيق في بحثك.