GC القائم على الكشف عن حمض Aldononitrile خلات الجلوكوزامين والموراميك Derivatized لتحديد بقايا الميكروبي في التربة

الهدف العام من هذا الفيديو هو تقديم وصف تفصيلي للتحليل القائم على تقنية GC لمشتقات نيتريل أسيتات Aldon من الجلوكوزامين وحمض المويك المستخلصة من التربة. تبدأ العملية بالهضم الحمضي، مما يؤدي إلى تكسير البوليمرات العضوية وتحرير الجلوكوزامين وحمض المويك. بعد ذلك، يتم فصل وتنقية مونومرات السكريات الأمينية من المحلول الخليط.

يتبع ذلك عملية الاشتقاق لتحويل تلك السكريات الأمينية إلى أسيتات ألدون نيتريل متطايرة للتحليل المعتمد على الكروماتوغرافيا الغازية. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في الاستخلاص سائل-سائل والتقدير بواسطة GC. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر فصلاً أساسياً لسكريات ألدون نيتريل أسيتات الأمينية التي تشع بين معايير myo و acetol و methyl glutamine من خلال GC مع كشف التأين باللهب.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى في أنها توازن بشكل مثالي بين دقة الحساسية والبساطة، والفصل اللوني الرسومي الجيد، والاستقرار عند تخزين العينات. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال دورة الكربون العالمية، مثل مساهمة الكائنات الدقيقة في SSE في مخازن الكربون التربوي المستقر. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى ومعلومات حول تراكم الحطام الميكروبي في التربة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في أوساط أخرى مثل الأنظمة المحيطية، والأنسجة البيولوجية، وحتى العينات الفضائية.

لبدء هذا البروتوكول، يتم تجفيف عينات التربة بالتجميد بعد جمعها من الميدان، ثم طحن عينات التربة وتجانسها باستخدام طاحونة تربة كروية أو هاون ومدقة. تزن عينات التربة المطحونة في دوارق تحلل سعة 25 milliliter. يضاف 10 milliliters من حمض الهيدروكلوريك بتركيز ستة molar إلى كل دورق تحلل، ويملأ بغاز النيتروجين قبل إغلاق السدادات بإحكام.

أجرِ التحلل المائي عند 105 °C في حضانة لمدة ثماني ساعات. وباستخدام مفتاح مؤقت تلقائي، أخرج الدوارق من الحضانة واتركها لتبرد حتى درجة حرارة الغرفة.

أضف 100 µL من المعيار الداخلي myo acetol إلى كل دورق. اخلط عن طريق التدوير، ثم قم بتجهيز أقماع بلاستيكية تصب في دوارق كمثرية الشكل سعة 200 mL. مع وضع وصلات زجاجية مصنفرة ذات مقاس مخروطي قياسي 24 40 فوق أكواب بلاستيكية لضمان الثبات.

قم بطي دوائر ورق ترشيح واتمان (Watman) رقم 2 النوعي إلى أرباع وضعها في الأقماع. قم برج كل دورق تحلل مائي ثم صب المادة الروبية في القمع. ولترشيح كل عينة، جفف الراشح باستخدام مبخر دوراني عند درجة حرارة 45 °C تقريباً مع تطبيق تفريغ هوائي.

قم بتعليق الرواسب المجففة من كل دورق زوجي باستخدام ثلاثة إلى خمسة ملليلترات من الماء واسكبها في أنبوب تيفلون سعة 40 ملليلتر. اغسل كل دورق بكمية ثانية من الماء. اضبط الرقم الهيدروجيني (pH) للعينات ليكون بين 6.6 و 6.8 باستخدام محلول هيدروكسيد البوتاسيوم بتركيز 1 مولار لترسيب أيونات المعادن والجزيئات العضوية الأخرى. بعد ذلك، قم بإزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي عند 2000 ×g لمدة 10 دقائق عقب عملية الطرد المركزي.

صب السوائل الطافية في أنابيب زجاجية سعة 40 milliliter وقم بتغطية فتحات الأنابيب بـ paraform لتجميد السوائل الطافية، ثم اصنع ثقوباً في الـ paraform. قم بتجفيف السوائل الطافية المجمدة بالتجميد لإزالة كافة السوائل. وبمجرد تجفيف السوائل الطافية، قم بإذابة الرواسب باستخدام ثلاثة milliliters من الميثانول الجاف.

بعد الرج جيداً باستخدام جهاز الفورتكس (Vortexing)، قم بتغطية الأنابيب بإحكام ثم قم بالطرد المركزي عند 2000 ×g لمدة 10 دقائق. ولترسيب الأملاح، انقل الرواسب الطافية إلى قوارير تفاعل مخروطية سعة 3 مل، ثم قم بتبخيرها حتى الجفاف باستخدام جهاز تبخير سريع (VA machine) عند 45 °C أو تحت تيار خفيف من غاز النيتروجين الجاف. وبمجرد التبخير، أضف 100 µL من معيار الاستعادة وmethyl glutamine، و1 مل من الماء إلى كل قارورة.

بعد ذلك، قم بتجميد العينات قبل البدء في عملية الاشتقاق. قم بتحضير المحاليل القياسية كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، ثم قم بالتجفيف بالتجميد لكل من العينات والمحلول القياسي. حضّر كاشف الاشتقاق الذي يحتوي على 32 mg/mL من hydroxyl amine hydrochloride و 40 mg/mL.

أضف 300 µL من كاشف الاشتقاق إلى كل أنبوب من أنابيب التفاعل، ثم أغلق الأنابيب بإحكام ورجها جيداً باستخدام جهاز الرج (vortex). ضع الأنابيب المغلقة في حمام مائي عند درجة حرارة 75 إلى 80 °C لمدة 35 دقيقة.

أخرج القوارير من الحمام المائي واتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 1 mL من أنهيدريد الأسيتيك إلى كل قارورة تفاعل سعة 3 mL، وأغلقها بإحكام ثم اخلطها جيداً باستخدام جهاز المازج الدوامي (vortex). تلي ذلك مرحلة حضانة ثانية في حمام مائي عند درجة حرارة 75 إلى 80 °C لمدة 25 دقيقة.

أخرج القوارير من الحمام المائي واتركها لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. لبدء عملية الفصل والقياس، أضف 1.5 milliliters من di chloro methane إلى كل أنبوب، ثم استخدم جهاز الـ vortex. بعد إضافة one milliliter من حمض الهيدروكلوريك بتركيز one molar إلى كل قارورة والرج جيداً باستخدام الـ vortex، اترك المحاليل دون تحريك حتى تنفصل الطورتان.

قم بسحب الطور المائي العلوي والتخلص منه. وباستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر وبالطريقة نفسها، استخلص الطور العضوي ثلاث مرات، على أن تكون خطوة الغسل الأخيرة باستخدام 1 مل من الماء. يجب توخي دقة خاصة لضمان إزالة كافة أجزاء الطور المائي العلوي.

جفف المحلول النهائي باستخدام جهاز تبخير سريع (VAP) عند 45 °C أو باستخدام تيار من غاز النيتروجين، ثم أذب كل عينة في 300 µL من ethyl acetate hexane، وانقلها إلى أنابيب زجاجية كهرمانية ذات سدادات لولبية سعة 2 mL مع إدراج أنبوب صغير الحجم وأغلقها بإحكام من أجل التقدير الكمي الذي يتم تحليله بواسطة الكروماتوغرافيا الغازية مع كاشف التأين باللهب باستخدام عمود شعري غير قطبي من السيليكا المنصهرة مثل DB five كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد التشغيل والتحليل القياسيين، اضبط معدل تدفق الغاز الحامل بحيث تخرج مشتقات acetol glucosamine و mu amic acid عند 250 °C، بينما يخرج end methyl glutamine عند 270 °C.

قم بإجراء حقن تقسيم بنسبة 1 إلى 30 وبحجم 1 µL، مع ضبط مدخل جهاز GC عند 250 °C باستخدام جهاز أخذ عينات تلقائي بعد تشغيل جهاز الكروماتوغرافيا الغازية. وكخطوة نهائية لهذا الإجراء، قم بالتحقق من صحة المشتق باستخدام طرق الكروماتوغرافيا والمطيافية الموضحة في البروتوكول المكتوب. تظهر هنا أمثلة لتحليل glucosamine وuremic acid من عينات قياسية ومن عينة تربة، وبالإضافة إلى glucosamine وmuic acid، يمكن أيضاً تحديد اثنين من متصاوغات glucosamine وهما osain وgalactose amine في آن واحد باستخدام هذه الطريقة، وذلك بناءً على الكمية الدقيقة للمواد القياسية المطبقة وعوامل الاستجابة لكل من المعيارين الداخليين.

يمكن تحديد كمية هذه المؤشرات الحيوية في عينات التربة. كما تم استخدام معيار الاسترداد لمراقبة عملية الاشتقاق نوعياً. وتظهر هنا مخططات تكوين أسيتات ألدون نيتريل، ومشتق الجلوكوزامين، وحمض المويك.

يمثل الرقم واحد تفاعل النتريل، بينما يمثل الرقم اثنين عملية الأستلة. وقد تمت دراسة التراكيب المقترحة لشظايا الأيونات المتكونة عند التأين الإلكتروني من خلال مقارنة أطياف الأيونات للعينات التي تم تحضيرها بدمج نظائر مختلفة. يوضح الشكل هنا الإزاحة في الكتلة للأيون السائد لمشتق نتريل أسيتات ألدون للجلوكوزامين في سيناريوهات مختلفة.

في هذا المثال، تم التحضير باستخدام عوامل غير معلمة بالإضافة إلى أنهيدريد الأسيتيك المعلم نظائرياً، والجلوكوزامين المعلم نظائرياً. تمثل النجمة الموجودة على البنية الكيميائية ذرة النظير الثقيل أو مجموعة النظائر. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على ظروف خالية من الماء بدقة أثناء عملية الاشتقاق.

يجب أن تكون كل من المذيبات العضوية والأواني الزجاجية المستخدمة في هذه المرحلة جافة. وبينما تبيع العديد من الشركات الموردة مذيبات لامائية، يمكن تجفيف المذيبات المتاحة عن طريق تمريرها عبر أعمدة تحتوي على كواشف تجفيف مثل كبريتات المغنيسيوم. عقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل قياس طيف الكتلة لنسب العناصر من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تفاعل الجماليات الكبيرة، ودوران الكربون أو النيتروجين وتراكمهما في التربة عن طريق التمييز بين الكائنات الكبيرة الحية والميتة بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات ekology الكلية وبيولوجيا التربة وكيميائها لاستكشاف المساهمات الكلية في المادة العضوية للتربة، وعمليات الاحتجاز في النظم البرية الطبيعية أو المدارة.