التغلب على عدم التجاوب في التجارب الذاتية التهاب الدماغ (EAE) سلالات الفئران المقاومة للنقل بواسطة بالتبني والتحدي الأنتيجين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز التهاب الدماغ والنخاع الشوكي المناعي الذاتي (EAE) بشكل ثابت وسهل في أي سلالة من الفئران، بما في ذلك السلالات المعروفة بمقاومتها لتحفيز EAE. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحصين الفئران المانحة أولاً ببروتينات محددة للميالين أو مستضدات ببتيدية، مستحلبة في مادة مساعدة كاملة طازجة. وبعد 10 أيام، يتم عزل العقد الليمفاوية من الفئران المانحة، ثم يتم إعادة تحفيز خلايا العقد الليمفاوية في المختبر عن طريق زراعتها مع المستضد ذاته لمدة تتراوح بين أربعة إلى خمسة أيام.

بعد ذلك، يتم نقل الخلايا تكيفياً إلى فئران متلقية سليمة. ستطور سلالات الفئران القابلة للإصابة مرض EAE في غضون 8 إلى 14 يوماً لتحفيز EAE في سلالة مقاومة. وبعد 14 يوماً من النقل التكيفي، تم تحصين الفئران المتلقية بالمستضد في CFA.

باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحفيز التهاب الدماغ والنخاع التجريبي (EAE) في سلالات الفئران المقاومة. تكمن الميزة الرئيسية لبروتوكول النقل التكيفي والتحدي لتحفيز EAE في أنه يسمح بتحفيز المرض بشكل موثوق، حيث نادراً ما نلاحظ نسبة إصابة سريرية أقل من 100%.

يمكننا تخصيص البروتوكول لتحفيز المرض في سلالات الفئران القابلة للإصابة، ولكن الأهم من ذلك هو أنه يمكننا استخدام هذا البروتوكول لتحفيز التهاب الدماغ والنخاع التجريبي (EAE) في العديد من سلالات الفئران التي كانت تُعتبر سابقاً مقاومة للمرض. عرض الإجراءات. معنا اليوم كبير الباحثين المساعدين، تشا تشينغ.

ابدأ بتحضير محلول من MBP بتركيز 2 mg/mL في PBS. استخدم سرنجة زجاجية مطحونة مزودة بقفل لوري لسحب 100 µL من محلول المستضد لكل فأر سيتم تحصينه.

باستخدام محقنة منفصلة، اجمع حجماً مساوياً من مساعد فرويد الكامل H 37 ra. بعد ذلك، وباستخدام صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات، صِل المحقنتين وادفع المكبسين ذهاباً وإياباً لخلط المستضد والمساعد حتى يتكون مستحلب. وللتحقق من حدوث ذلك، انقل المحلول إلى إحدى المحقنتين وافصل المحقنة الفارغة.

اسحب مكبس المحاقن الفارغة للخلف قليلاً، ثم فرّغ قطرة من الخليط المتبقي في دورق يحتوي على ماء نظيف في درجة حرارة الغرفة. إذا تشتتت القطرة، أعد توصيل المحاقن وواصل عملية الخلط. أما إذا ظلت القطرة متماسكة وشكّل المستحلب، فكرر الاختبار لجمع المستحلب.

لأغراض التحصين. قم بتوصيل محقنة بلاستيكية سعة 1 mL بالمحقنة الزجاجية التي تمت إزالة مكبسها. انقل المحلول بعناية إلى المحقنة البلاستيكية حتى تمتلئ إلى الحافة.

ثم أدخل المكبس البلاستيكي واطرد بعض المستحلب بحيث يتبقى 1.2 milliliters بالضبط. يجب ألا يكون هناك فقاعات هواء محبوسة في المحقنة. إذا تم تنفيذ هذا الإجراء بشكل صحيح.

افصل الحقنة البلاستيكية. قم بتركيب إبرة ذات مقاس 26، واملأ الحجم الفارغ للإبرة عن طريق دفع المكبس حتى علامة 1 ملليلتر. أمسك الفأر بإحكام وثبّت الذيل للخلف بين الإصبع البنصر والخنصر بحيث يسهل الوصول إلى الصدر والبطن. تحت الجلد.

احقن 50 µL من المستحلب في الصدر فوق الإبط الأيمن مباشرةً. إذا تم الحقن بشكل صحيح، ستظهر نتوءات بيضاء صغيرة في موقع الحقن. كرر الإجراء فوق الإبط الأيسر، ثم اترك الذيل وأمسك بالقدم اليمنى، بحيث يكون الخاصرة اليمنى للفأر مكشوفة.

احقن 50 µL من المحلول أسفل القفص الصدري مباشرةً. حرر القدم اليمنى. أدر الفأر في الاتجاه الآخر وكرر عملية الحقن في الجانب الأيسر.

بعد سبعة إلى 10 أيام من التحصين، يتم استخلاص العقد الليمفاوية من الحيوانات التي تم قتلها رحيمًا. أولاً، ضع الفأر على ظهره مع مد أطرافه وتثبيتها على لوحة التشريح باستخدام الدبابيس.

رُش الفأر بالإيثانول. ثم باستخدام أدوات معقمة، اصنع شقاً طولياً في جلد الفأر من أسفل البطن وصولاً إلى الذقن.

أجرِ شقاً آخر من البطن نزولاً إلى إحدى الساقين، ثم نزولاً إلى الساق الأخرى. قم بسلخ الجلد عن الفأر وتثبيته بالدبابيس على لوحة التشريح.

قم أيضاً بقص الجلد على طول الأطراف الأربعة. ثم قم بإزالة الجزء العلوي من سدائل الجلد وتثبيته باستخدام الدبابيس على كلا الجانبين؛ حيث يجب أن تكون العقد اللمفاوية الإربية والإبطية، والتي توجد عادةً بالقرب من المنطقة الإربية أو الإبطين، مرئية ككتل معتمة صغيرة مباشرة تحت الجلد. استخدم ملقطين دقيقين لإزالة النسيج الضام الموجود فوق العقدة اللمفاوية الأولى برفق.

مع الحرص على عدم تمزيق الأوعية الدموية أثناء هذه العملية. وبمجرد إزالة النسيج الضام، ضع زوجاً من الملاقط تحت العقدة اللمفاوية واسحبها بعيداً عن الجسم. ثم انقل العقدة اللمفاوية إلى طبق بتري بقطر 35 millimeter يحتوي على PBS معقم، واجمع العقد اللمفاوية الثلاث الأخرى بنفس الطريقة.

بمجرد الانتهاء من جمع كافة العقد اللمفاوية، انقل طبق بتري إلى خزانة السلامة البيولوجية. وباستخدام ظهر مكبس حقنة معقمة، قم بتجنيس العقد اللمفاوية لتحرير الخلايا، ثم قم بترشيح المعلق عبر شبكة نايلون في أنبوب مخروطي لإزالة الحطام.

بعد ذلك، يتم ضبط الحجم إلى 50 milliliters باستخدام PBS معقم، ثم تُطرد الخلايا مركزياً لمدة 10 دقائق. وبعد عملية الطرد المركزي، تُعاد تعليق الخلايا في حجم صغير من وسط زراعة الخلايا المسخن مسبقاً، ثم يتم عد الخلايا الحية. اضبط التركيز ليصل إلى أربعة أضعاف 10 to the six خلايا لكل milliliter.

بعد ذلك، يتم توزيع الخلايا في طبق يحتوي على 24 بئراً بمعدل 2 mL لكل بئر. أضف مستضد MVP إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي قدره 100 µg/mL. وبمجرد إضافة المستضد.

قم بحضن الخلايا عند 37 °C لمدة خمسة أيام. وبمجرد إعادة تحفيز الخلايا، قم بحصادها عن طريق السحب والضخ برفق باستخدام الماصة، ثم انقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL. قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1000 RPM لمدة 10 دقائق، ثم أعد تعليق الراسب في حجم صغير من PBS المعقم.

ثم قم بعدّ الخلايا وضبط تركيز الخلايا الحية ليصل إلى 2.5 × 10⁸ خلية لكل milliliter باستخدام PBS. اسحب الخلايا في حقنة وثبت بها إبرة قياس 26 gauge لإجراء النقل التبنيّ. احقن 0.2 milliliters من الخلايا وريدياً في ذيل كل فأر لتحفيز الفئران المقاومة بعد أسبوعين من النقل التبنيّ.

يتم حقن الحيوانات بـ 200 micrograms من المستضد في حجم 200 microliters من المستحلب بنفس الطريقة التي تم بها تحصين الفئران المانحة. بعد سبعة إلى 10 أيام من التحدي، سيتطور المرض الشللي ويمكن مراقبة تطوره. يبدأ المرض بضعف في الذيل.

عندما يكون الذيل رخواً، تُصنف درجة المرض بأنها الدرجة الأولى. وتكون الدرجة الثانية إذا أصيب الفأر بشلل في أحد الطرفين الخلفيين، والدرجة الثالثة إذا أصيب الطرفان الخلفيان بالشلل. أما الدرجة الرابعة فتكون عند إصابة كلا الطرفين الأماميين بالشلل.

في الدرجة الخامسة، يكون الفأر أكثر وفرة. وفي الدرجة السادسة، يكون الفأر ميتاً. وكما هو موضح هنا، بعد 7 إلى 14 يوماً من التحدي، ستصاب الفئران بمرض شللي أحادي الطور، والذي يمكن تصنيفه باستخدام معايير EAE التقليدية.

بينما قد تتعافى الفئران، إلا أنها لن تعاني من انتكاسة تلقائية. ويتطلب تحفيز المرض تحدياً نوعياً للمستضد. كما أن التحدي باستخدام CFA بمفرده أو باستخدام مستضد غير ذي صلة يفشل في إحداث المرض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لطريقة النقل التكيفي والتحدي لتحفيز التهاب الدماغ والنخاع الشوكي التجريبي (EAE). من خلال الجمع بين النقل التكيفي لخلايا العقد اللمفاوية النوعية للمستضد مع تحدٍ مستضدي تعزيزي، يمكن بسهولة تحفيز EAE في أي سلالة من الفئران. تتيح لنا هذه الطريقة التغلب على آليات المقاومة المتأصلة في بعض سلالات الفئران، وبالتالي تسمح بدراسة مقاومة المرض. وأيضاً.

ينبغي أن تكون هذه التقنية قابلة للتكيف بسهولة لدراسة أي عملية مرضية مناعية ذاتية.