التغلب على عدم التجاوب في التجارب الذاتية التهاب الدماغ (EAE) سلالات الفئران المقاومة للنقل بواسطة بالتبني والتحدي الأنتيجين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز EAE باستمرار وسهولة في أي سلالة فأر ، بما في ذلك تلك التي تشتهر بأنها مقاومة لتحريض EAE. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحصين الفئران المانحة أولا ببروتينات خاصة بالمايلين أو مستضدات الببتيد ، المستحلب في مادة مساعدة كاملة فريس. بعد 10 أيام ، يتم عزل الغدد الليمفاوية من الفئران المانحة ويتم إعادة تحفيز خلايا العقدة الليمفاوية في المختبر عن طريق زراعتها بنفس المستضد لمدة أربعة إلى خمسة أيام.

ثم يتم نقل الخلايا بالتبني إلى فئران متلقية ساذجة. ستتطور سلالات الفئران الحساسة إلى EAE في غضون ثمانية إلى 14 يوما لتحفيز EAE في سلالة مقاومة. بعد 14 يوما من النقل بالتبني ، تم تحصين الفئران المتلقية بمستضد في CFA.

باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تحفيز EAE في سلالات الفئران المقاومة. الميزة الرئيسية لبروتوكول النقل والتحدي التكيفي لإحداث EAE هي أنه يسمح بتحريض المرض بشكل موثوق. نادرا ما نرى أقل من 100٪ من الأمراض السريرية.

يمكننا تصميم البروتوكول لإحداث المرض وسلالات الفئران الحساسة ، ولكن الأهم من ذلك ، يمكننا استخدام هذا البروتوكول للحث على EAE في العديد من سلالات الفئران التي كانت تعتبر سابقا مقاومة للأمراض. إظهار الإجراءات. اليوم هو الباحث المساعد الرئيسي لدينا ، تشا تشينغ.

ابدأ بتحضير محلول ملليغرام لكل مليلتر من MBP. في برنامج تلفزيوني. استخدم حقنة زجاجية أرضية مزودة بقفل إغراء لسحب 100 ميكرولتر من محلول المستضد لكل فأر ليتم تحصينه.

باستخدام حقنة منفصلة ، اجمع حجما متساويا من مساعد فرويد الكامل H 37 ra. ثم باستخدام محبس ثلاثي الاتجاهات ، قم بتوصيل المحاقن وادفع الغطاسات ذهابا وإيابا لخلط المستضد والمساعد حتى يتم تشكيل مستحلب. للتحقق من أن هذه هي الحالة ، انقل المحلول إلى إحدى المحاقن وافصل المحاقن الفارغة.

اسحب المحاقن الفارغة واغمسها للخلف قليلا ، ثم قم بتفريغ قطرة من الخليط المتبقي في كوب من الماء النظيف في درجة حرارة الغرفة. إذا تشتت القطرة ، أعد توصيل المحاقن واستمر في الخلط. كرر الاختبار إذا ظل القطرة سليمة وتم تشكيل مستحلب لجمع المستحلب.

للتحصين. قم بتوصيل حقنة بلاستيكية سعة ملليلتر واحد بحقنة زجاجية تمت إزالة المكبس. انقل المحلول بعناية إلى المحقنة البلاستيكية ، واملأه إلى الحافة.

ثم أدخل المكبس البلاستيكي وطرد بعض المستحلب بحيث يبقى 1.2 مل بالضبط. يجب ألا تكون هناك فقاعات هواء محاصرة في المحقنة. إذا تم تنفيذ هذا الإجراء بشكل صحيح.

افصل المحقنة البلاستيكية. قم بتركيبه بإبرة قياس 26 واملأ حجم فراغ الإبرة عن طريق دفع المكبس إلى علامة مليلتر واحد. قم بتحريك الماوس بقوة وأمسك الذيل بين إصبع البنصر والخنصر بحيث يمكن الوصول بسهولة إلى الصدر والبطن. تحت الجلد.

حقن 50 ميكرولترا من المستحلب في الصدر فوق الإبط الأيمن مباشرة. إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح ، فسيظهر انتفاخ أبيض صغير في موقع الحقن. كرر الإجراء فوق الإبط الأيسر ، ثم حرر الذيل وأمسك بالقدم اليمنى ، مع تعريض الجانب الأيمن للماوس.

حقن 50 ميكرولتر من المحلول أسفل القفص الصدري مباشرة. اترك القدم اليمنى. أدر الماوس في الاتجاه الآخر وكرر الحقن على الجانب الأيسر.

7 إلى 10 أيام من التحصين. حصاد الغدد الليمفاوية من القتل الرحيم. ضع الفأر أولا على ظهره مع أطرافه الممتدة وتثبيتها على لوحة التشريح بالمسامير.

رش الماوس بالإيثانول. ثم باستخدام أدوات معقمة. قطع شق طولي في جلد الفأر من أسفل البطن حتى الذقن.

قم بعمل شق آخر من البطن إلى أسفل ساق واحدة. ثم أسفل الآخر. انزع الجلد عن الماوس وقم بتثبيته على لوحة التشريح.

قم أيضا بقطع الجلد على طول الأطراف الأربعة. ثم قم بتقشير وتأمين الجزء العلوي من اللوحات الجلدية بدبابيس على كلا الجانبين ، ويجب أن تكون الغدد الليمفاوية الأربية والإبطية ، والتي عادة ما تكون قريبة من الفخذ أو الإبطين ، مرئية ككتل صغيرة غير شفافة تحت الجلد مباشرة. استخدم ملقطين دقيقين لإزالة النسيج الضام فوق العقدة الليمفاوية الأولى برفق.

الحرص على عدم تعطيل الأوعية الدموية في هذه العملية. بمجرد إزالة النسيج الضام ، ضع زوجا واحدا من الملقط تحت العقدة الليمفاوية واسحبه بعيدا عن الجسم. انقل العقدة الليمفاوية إلى طبق بتري مقاس 35 ملم يحتوي على PBS معقم وحصاد الغدد الليمفاوية الثلاث الأخرى بنفس الطريقة.

بمجرد حصاد جميع الغدد الليمفاوية ، قم بنقل طبق بتري إلى غطاء السلامة الحيوية. باستخدام الجزء الخلفي من مكبس حقنة معقمة. تجانس الغدد الليمفاوية لتحرير الخلايا لإزالة الحطام ، وتصفية التعليق من خلال شبكة من النايلون في أنبوب مخروطي الشكل.

ثم اضبط مستوى الصوت إلى 50 مل باستخدام PBS معقم وقم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في حجم صغير من وسط زراعة الخلايا الدافئة وعد الخلايا القابلة للحياة. اضبط التركيز إلى أربعة في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.

ثم قم بوضع الخلايا على ملليلتر لكل بئر في طبق 24 بئر. أضف مستضد MVP إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100 ميكروغرام لكل مليلتر. بمجرد إضافة المستضد.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. بمجرد إعادة تحفيز الخلايا ، قم بحصادها عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق وأعد تعليق الحبيبات في حجم صغير من PBS المعقم.

ثم عد الخلايا واضبط تركيز الخلية القابلة للحياة إلى 2.5 في 10 إلى الخلايا الثامنة لكل مليلتر مع PBS. اسحب الخلايا في حقنة وقم بتركيبها بإبرة قياس 26 لإجراء النقل بالتبني. حقن 0.2 مل من الخلايا عن طريق الوريد في ذيل كل فأر لتحدي الفئران المقاومة لأسابيع بعد نقل التبني.

حقن ب 200 ميكروغرام من المستضد بحجم 200 ميكرولتر من المستحلب بنفس الطريقة التي تم بها إجراء تحصين الفئران المانحة. بعد سبعة إلى 10 أيام من التحدي ، سيتطور مرض الشلل ويمكن مراقبة تطوره. يبدأ المرض بضعف في الذيل.

عندما يكون الذيل ضعيفا ، يتم تصنيف المرض ، ويتم تصنيف مرض واحد. ثانيا ، إذا أصيب الفأر بالشلل في أحد الأطراف الخلفية ، وثلاثة ، إذا أصيب كلا الطرفين الخلفيين بالشلل. الصف الرابع هو عندما يكون كلا الطرفين الأماميين مشلولين.

الصف الخامس ، الماوس أكثر وفرة. والصف السادس ، مات الفأر. كما هو موضح هنا ، بعد سبعة إلى 14 يوما من التحدي ، ستصاب الفئران بمرض شلل أحادي الطور ، والذي يمكن تصنيفه باستخدام معايير EAE الكلاسيكية.

بينما قد تتعافى الفئران ، فإنها لن تنتكس تلقائيا. يتطلب تحريض المرض تحديا محددا للمستضد. فشل التحدي مع CFA وحده أو مستضد غير ذي صلة في إثارة المرض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لطريقة النقل والتحدي بالتبني لحث EAE. من خلال الجمع بين النقل التكيفي لخلايا العقدة الليمفاوية الخاصة بالمستضد مع التحدي المستضد المعزز ، يمكن للمرء بسهولة تحفيز EAE في أي سلالة فأر. تسمح لنا هذه الطريقة بالتغلب على آليات المقاومة المتأصلة في بعض سلالات الفئران ، وبالتالي تسمح بدراسة مقاومة الأمراض. أيضًا.

يجب تكييف هذه التقنية بسهولة لدراسة أي عملية من أمراض المناعة الذاتية.