ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل

مرحباً، أنا شامال، زميل ما بعد الدكتوراه مع TUR Kika في المركز الوطني للعلوم البيولوجية في الهند. سأوضح لكم في هذا الفيديو كيفية تصنيع جهاز ميكروي حيوي، باستخدام تقنيات الطباعة اللينة في بيئة مختبرية عادية. سأستخدم هذه الأجهزة للتصوير الخلوي ودون الخلوي عالي الدقة للكائنات النموذجية الجينية.

سيتيح البروتوكول الحالي للباحثين إجراء هذا التصوير بفاصل زمني في كائنات حية سليمة دون الحاجة إلى التخدير. لذا، فلنبدأ. لقد قمنا بتطوير جهاز ميكروفوني بسيط لإجراء التصوير الحي في الجسم (in vivo) دون تخدير للكائنات النموذجية الجينية مثل *Caenorhabditis elegans*، وذباب الفاكهة *Drosophila* السليم، وأجنة سمك الزيبرا.

نوضح في هذه الدراسة جهاز تحريك شفاف يعتمد على الغشاء، تم تصنيعه باستخدام القولبة اللينة لـ PDMS. ومن أجل تثبيت كائن حي واحد، نقوم بتحديد موقع الحيوان الفردي تحت مجهر ستيريو والتقاطه باستخدام قطرة صغيرة من محلول منظم بواسطة ماصة دقيقة، ثم إدخال الحيوان الفردي في قناة التدفق وتثبيته تحت غشاء PTMS. وذلك باستخدام وصلة غاز نيتروجين مضغوط عبر صمام كروي ثلاثي الاتجاهات.

صمم هياكل الموائع الدقيقة باستخدام برنامج التصميم. نظف رقائق السيليكون بمقاس 2 cm في 2 cm في محلول KOH بنسبة 20% لمدة دقيقة واحدة ثم اشطفها بالماء المقطر. جفف القطع تيار من غاز النيتروجين وقم بإزالة الرطوبة منها عند درجة حرارة 120 °C لمدة أربع ساعات.

قم بطلاء قطع السيليكون بمادة hexa metal باستخدام جهاز الطلاء الدوراني بسرعة 500 RPM لمدة خمس ثوانٍ، ثم بسرعة 3000 RPM لمدة 30 ثانية. قم بطلاء رقائق السيليكون بمادة SU 8 2 0 2 5 بسرعة 500 RPM لمدة خمس ثوانٍ، ثم بسرعة 2000 RPM لمدة 30 ثانية. أجرِ عملية الخبز المبدئي (Soft bake) لقطع السيليكون المطلية عند درجة حرارة 65 °C لمدة دقيقة واحدة، ثم عند 95 °C لمدة 10 دقائق.

عرّض الرقائق المطلية بـ SU eight والمخبوزة لمصباح UV بقدرة 200 watt من خلال القناع الضوئي للتصميم الأول والتصميم الثاني لإنشاء طبقة تدفق وطبقة تحكم على التوالي. قم بإجراء الخبز اللاحق للرقائق عند 65 degrees Celsius لمدة دقيقة واحدة و95 degrees Celsius لمدة 10 minutes. ثم قم بتحميض القطع باستخدام محلول SUA developer لمدة 20 minutes.

قم بتشفير القطع باستخدام بخار tri chloro per fluoro CET seline في مجفف لمدة ساعتين. اخلط poly dyl xox base وعامل المعالجة بنسبة 10 إلى 1 من حيث الوزن. قم بإزالة الغازات من الخليط للتخلص من جميع فقاعات الهواء الناتجة أثناء الخلط.

صب خليط PDMS بسمك 5 mm فوق رقائق السيليكون ذات نمط وزن SC للتصميم. قم بذلك بلطف لتجنب تكون فقاعات هوائية. استخدم تقنية الطلاء الدوراني لعمل طبقة موحدة من PDMS على رقائق السيليكون للتصميم المخصص لطبقة التدفق بسرعة 500 RPM لمدة 5 ثوانٍ ثم 1500 RPM لمدة 30 ثانية.

يتم خبز كل من قطعتي التصميم الأول والتصميم الثاني اللتين تحتويان على PDMS عند درجة حرارة 50 °C لمدة ست ساعات. يتم قص قطعة PDMS من الركيزة السيليكونية باستخدام شفرة فرعية تحتوي على نمط SCH 2. يتم ثقب ثقب صغير في الجزء العلوي من الخزان الذي يربط المصيدة الرئيسية في قالب PDMS.

باستخدام إبرة ثقب دقيقة أو إبرة قياس 18 gauge. يتم تعريض السطح السفلي لطبقة التحكم والسطح العلوي لطبقة التدفق لبلازما الهواء بقوة 18 wat لمدة دقيقتين. توضع السطحان المعالجان بالبلازما معاً مع الضغط بلطف، ثم تُخبز في درجة حرارة 50 degrees Celsius لمدة ساعتين.

قم بقص الأجهزة المترابطة من الركيزة السيليكونية باستخدام تصميم SUH رقم واحد، ثم اصنع ثقوب وصول عند خزانات المدخل والمخرج لقناة التدفق. قم بكشف الجزء السفلي من PD للجهاز وغطاء زجاجي نظيف. قم بالتعريض لبلازما الهواء بجهد 18 فولت لمدة دقيقتين.

ضع السطحين المعالجين بالبلازما مع ضغط خفيف، ثم قم بخبزهما عند درجة حرارة 50 درجة لمدة ساعتين. احفظ الجهاز في بيئة نظيفة لاستخدامه مستقبلاً. بعد تصنيع الأجهزة، سأوضح لكم كيفية استخدام غشاء PDMS لتثبيت *C. elegans* داخل الجهاز. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب microflex بمنظم إمداد غاز النيتروجين المضغوط والطرف الآخر بخزان المصيدة الرئيسي عبر إبرة قياس 18 gauge.

يسمح استخدام صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات في منتصف توصيلة الأنبوب بتطبيق الضغط على الغشاء أو تحريره. املأ الأنبوب المتصل بجهاز PDMS بعمود من الماء المقطر بطول 10 centimeter قبل توصيله بخزان المصيدة الرئيسية. افتح صمام إمداد النيتروجين للوصول إلى ضغط PSI البروتيني وراقب انحراف غشاء المصيدة الرئيسية باتجاه قناة التدفق باستخدام تكبير منخفض لمجهر مقلوب.

قم بتحرير صمام التوقف ثلاثي الاتجاهات ووضع الغشاء في وضع السكون. املأ قناة التدفق بالمحلول المنظم لمدة 10 دقائق. قبل بدء التجربة، حدد موقع فرد واحد من *Strongylocentrotus purpuratus* باستخدام مجهر ستيريو منخفض التكبير.

التقط حيواناً واحداً باستخدام حجم صغير من محلول المنظم داخل طرف ماصة دقيق (micro tip). ادفع الحيوان المنفرد عبر مدخل قناة التدفق. اضبط ضغط الماصة لوضع الحيوان الفردي تحت المصيدة الرئيسية.

قم بزيادة الضغط على غشاء PDMS ببطء لتثبيت الحيوان مقابل حدود القناة، ثم قم بتثبيته بضغط يتراوح من 7 إلى 14 PSI. استخدم مجهراً مقلوباً مضبوطاً على الإعدادات المطلوبة للحصول على صور عالية الدقة سواء بالتصوير الميداني أو التصوير الفلوري. قم بالتقاط صور فلورية مفردة أو صور فلورية متتابعة زمنياً بمعدل إطارات محدد مسبقاً.

قم بتنفيس ضغط المصيدة وراقب السلوك الحركي للحيوان. ولمدة خمس دقائق وبقوة تكبير منخفضة، قم بشطف الحيوان وإدخال حيوان جديد. لتكرار خطوات DevOp، استخدم طرف الماصة الدقيقة المقطوع لالتقاط يرقة oph واحدة وإدخالها في جهاز الفيريت الدقيق ذو الحجم الأكبر.

ادفع اليرقة الواحدة عبر مدخل قناة التدفق. زد ضغط غشاء PDMS ببطء وثبّتها بضغط ESI قدره سبعة. استخدم مجهراً مقلوباً للتصوير الفلوري بتكبير منخفض، والتقط صوراً فلورية بنظام الفاصل الزمني (time lapse) لتصوير عملية النقل.

قم بتنفيس ضغط المصيدة ومراقبة السلوك الحركي لليرقة تحت تكبير منخفض. استخدم نفس مبدأ الجهاز لتثبيت والحصول على صور بفاصل زمني لأسماك الزيبرا بعد 30 ساعة من الإخصاب. صمام القلب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على تصنيع أجهزة دقيقة مماثلة في مختبرك الخاص واستخدامها بنجاح في تثبيت الكائنات الحية لإجراء تجارب مذهلة وعالية الدقة. شكراً لمشاهدة الفيديو وتمنياتنا لك بالتوفيق في تجاربك.