واحدة من خلية قياس إفراز الدوبامين في وقت واحد مع المشبك الجهد وAmperometry

الهدف من هذا الإجراء هو قياس النقل العكسي للدوبامين في الخلايا العصبية التي يتم تثبيت الجهد باستخدام مشبك التصحيح المتزامن وقياس الحرارة لقياس إطلاق D بوساطة DOT. يتم تحقيق ذلك عن طريق اختبار سلامة القطب الحراري أولا مع الدوبامين. الخطوة الثانية هي وضع القطب الحراري بالقرب من الخلية وتحقيق رقعة خلية كاملة من الخلايا العصبية باستخدام ماصة رقعة.

بعد ذلك ، يتم التحكم في جهد الخلية باستخدام ماصة التصحيح ويتم تسجيل الدوبامين بوساطة DAT الذي تطلقه الخلية باستخدام قطب حراري في وقت واحد. الخطوة الأخيرة هي إضافة مانع DAT وتسجيل الخلية بأكملها وتيارات قياس الحرارة مرة أخرى للسماح بطرح التيار الذي يتوسط فيه ناقل الدوبامين على وجه التحديد. تكمن أهمية هذه التقنية في القدرة على قياس النقل العكسي للدوبامين عبر ناقل الدوبامين مع التحكم في نفس الوقت في جهد الخلايا العصبية الدوبامينية.

يتطلب مشبك التصحيح المتزامن ونظام تسجيل قياس الضغط مجهريا مقلوبا مع بصريات DIC ممتازة وعدسة لمسافات عمل طويلة لتوليد مصدر ضوء تيار مستمر للنظام. مع انخفاض مستوى الضجيج الكهربائي ، قم بتوصيل منارة المجهر ببطارية السيارة. يتم استخدام المعالجات الدقيقة الهيدروليكية لأنها لا تساهم بشكل ملحوظ في مستويات الضوضاء في تكويننا.

يتم استخدام مناور اليد اليمنى لمشبك الجهد وتسجيل الخلية بأكملها ومناور اليد اليسرى لقياس الحرارة. لتحضير القطب الكهربائي للتسجيل بالجملة، اسحب ماصة كوارتز باستخدام مجتذب P 2000. عادة ، نستخدم ماصة بمقاومة من ثلاثة إلى أربعة ميجا أوم.

بعد ذلك ، املأ القطب بمحلول الماصة الذي يحتوي على دوبامين واحد ملليمول. ثم قم بتثبيته على حامل الماصة على المناور الأيمن. تأكد من لف الحاوية التي تحتوي على محلول الماصة المحتوي على الدوبامين بورق الألمنيوم واحتفظ بها على الجليد عندما لا تكون قيد الاستخدام.

نظرا لأن الدوبامين قابل للأكسدة ، فإن الحفاظ على المحلول على الجليد ومحميا من الضوء سيقلل من معدل الأكسدة. قم بربط السلك الفضي في حامل القطب الكهربائي ، ثم قم بربط المحول البارامتري am على حامل القطب. بعد ذلك ، املأ القطب الكهربائي ثلاثي بما يكفي من الزئبق للاتصال بالسلك الفضي.

عندما يتم تركيب القطب الكهربائي على المحول ، تأكد من فحص ألياف الكربون منخفضة الضوضاء الاحترافية CFE والقطب الكهربي البارامتري تحت المجهر للتأكد من أن الطرف نظيف وسليم. تأكد من تثبيت الطرف البعيد من ألياف الكربون لحماية طرف ألياف الكربون من التلف. ثم قم بتركيب القطب الكهربائي الاحترافي CFE Tric.

بعد ذلك ، قم بتركيب القطب المجمع على المناور الهيدروليكي الأيسر لفحص سلامة القطب الكهربائي النهائي. قم بخفضه في طبق بتري ذو قاع زجاجي يحتوي على المحلول الخارجي. سجل خط الأساس الحالي في حالة عدم وجود الدوبامين.

ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول الدوبامين المليمول إلى الطبق. يجب أن يسجل القطب المتري الجيد زيادة في التيار التأكسدي. تأكد من التحقق من سلامة القطب المتري emper قبل التجارب وبعدها.

في هذا الإجراء ، استرجع الخلايا العصبية أو الخلايا المصممة للتعبير عن ناقل الدوبامين الموضوع في طبق بتري القاع الزجاجي من الحاضنة. اغسل الخلايا أو الخلايا العصبية الدوبامين برفق ثلاث مرات بمحلول خارجي دافئ. لتصور الخلايا وإجراء التجربة ، قم بتركيب طبق بتري ذو القاع الزجاجي على مرحلة المجهر وابحث عن النقطة المحورية الصحيحة لتصور الخلايا بوضوح.

بعد ذلك ، قم بالضغط الإيجابي على قطب التصحيح. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد ، قم بإحضار كلا القطبين برفق إلى المحلول وأقرب الخلية باستخدام المتلاعبين الدقيقين. ثم ضع القطب المتري emper على الجانب الأيسر من الخلية وقطب التصحيح على اليمين.

عندما يلامس قطب الرقعة الخلية. ضع شفطا خفيفا عن طريق الفم أو المحقنة لتشكيل ختم جيجا على الخلية. بعد ذلك ، قم بتمزيق الختم بالشفط لتحقيق تكوين الخلية بالكامل ، واترك خمس إلى ثماني دقائق لغسيل الكلى الذي يحتوي على محلول داخلي يحتوي على الدوبامين في الخلية.

ثم سجل التيارات بوساطة DAT عن طريق تحريك جهد غشاء الخلية بين سالب 60 وزائد 100 مللي فولت من جهد الاحتفاظ البالغ 40 مللي فولت تحت الصفر عبر الماصة. لتحديد الدوبامين المحدد بوساطة DAT flx ، سجل التيارات المترية emper في غياب ووجود مضاد DAT. ثم يتم تحديد التيار التريكي المحدد بوساطة DAT عن طريق طرح الآثار المسجلة في وجود مضاد DAT من آثار emper المسجلة بدون الخصم.

يتوافق الانحراف التصاعدي في التيارات التريكية مع التدفق الخارجي للدوبامين الموضح هنا. تم تسجيل التيارات التي توسطت فيها DAT عن طريق تدرج جهد الغشاء بمقدار 20 مللي فولت بين سالب 60 وزائد 100 مللي فولت من إمكانية الاحتفاظ بأنها سالب أربعة مللي فولت C مع الماصة التي تحتوي على اثنين من المليمولار الدوبامين في وضع ترقيع الخلية بأكملها. فيما يلي تيار متري Emper المكتسب في وقت واحد مع تيار الخلية بأكمله.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس النقل العكسي للدوبامين عبر ناقل الدوبامين في خلية عصبية مثبتة بالجهد. تذكر التحقق من سلامة القطب البارامتري قبل التجارب وبعدها ، ولا تنس طرح الآثار المسجلة في وجود هذا الخصم من آثار التريكات المسجلة بدون الخصم.