رصد انتقاصية ومؤكسد نصف ردود فعل من Monooxygenase فلافين التي تعتمد على استخدام توقف تدفق الطيفي

يستخدم هذا الإجراء أداة تدفق متوقفة للكشف عن الأشكال الطيفية المختلفة ل SID A وقياس المعدلات. يمكن تقسيم التفاعل المحفز بواسطة SID A إلى تفاعلات نصف اختزال ومؤكسدة ل FAD. يرتبط الفلافين المؤكسد ب N-A-D-P-H ويتفاعل لتكوين انخفاض الفلافين و NADP بالإضافة إلى تفاعل الأكسجين الجزيئي وارتباط الأورنيثين يؤدي إلى تكوين C أربعة.

هيدروكسي فلافين بعد هيدروكسيل أورنيثين ، يجف هيدروكسي فلافين لتشكيل الإنزيم المؤكسد. يظل NA DP plus مرتبطا طوال الدورة التحفيزية وهو آخر ركيزة يتم إطلاقها. تسهل أداة التدفق المتوقفة الخلط السريع لكميات صغيرة من المواد المتفاعلة والسجلات.

التغيرات الطيفية بمرور الوقت يسمح مقياس الطيف الضوئي لفقدان المواد للمرء بقياس معدل التكوين والتفاعل المحفز بالإنزيم على وجه التحديد للمواد الوسيطة العابرة. سيوضح عضوان من مختبري ، ريتا روبنسون وإنفيرو روميرو ، هذه التجارب باستخدام المجموعة A في نكهة الأكسجين الأحادي كنظام نموذجي. صب 250 مل من 100 مللي مولار من فوسفات البوتاسيوم في قارورة بوشنر سعة 500 مل تحتوي على شريط تحريك.

أغلق القارورة بسدادة مطاطية ، ثم ضعها على لوح تحريك وقم بتوصيل الأنبوب القصير للقارورة بخط الخاصرة. قم بتفريغ المخزن المؤقت تحت الفراغ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض ، متبوعا بالتنظيف بالأرجون. كرر خمس مرات.

أخيرا اغسل القارورة بالأرجون لمدة 10 ثوان. افصل القارورة عن مشعب التفريغ وضعها داخل صندوق القفازات. استمر في التقليب بقوة مع فتح القارورة.

املأ محاقن الخزان ب 18.13 وحدة لكل مليلتر من محلول الجلوكوز أوكسيديز و 100 مليل مولار. الآن اضبط صمامات القيادة على موضع التحميل. املأ محاقن محرك الأقراص.

بعد ذلك ، أدر الصمام F إلى موضع القيادة. باستخدام برنامج التحكم في البيانات الاحترافية ، انقر فوق إفراغ حقنة الإيقاف ، ثم ادفع المخزن المؤقت من حقنة محرك الأقراص F عبر دائرة التدفق عن طريق رفع ذاكرة الوصول العشوائي المقابلة يدويا. استمر في توازن محاقن القيادة الثلاثة الأخرى لمدة ساعة.

الآن أعد ملء محاقن الخزان وكرر التنظيف لنظام التدفق المتوقف. لتحضير عازلة مشبعة بالأكسجين. قم بفقاعة المحلول بأكسجين بنسبة 100٪ لمدة ساعة واحدة مع التحريض.

ثم قم بإزالة الإبرة القصيرة من القارورة وانتظر 10 ثوان. استمر في إزالة الإبرة الطويلة ووضع القارورة المغلقة في صندوق القفازات. لحل N-A-D-P-H.

ضع أنبوب einor سعة 1.5 مل يحتوي على ملليغرام واحد من N-A-D-P-H في صندوق القفازات. تذوب في 300 ميكرولتر من محلول فوسفات البوتاسيوم اللاهوائي 100 مللي مولار. الرقم الهيدروجيني 7.5.

قم بإزالة 30 ميكرولتر لتحديد تركيز N-A-D-P-H. الآن لإزالة الأكسجين من مخزون الإنزيم ، انقل المحلول إلى قارورة سعة 25 مليلتر تحتوي على غطاء شريط تحريك مع قمح وسدادة وختم من الألومنيوم. ضعها على الثلج.

قم بتوصيله بخط شلينك ، ثم قم بتفريغ الهواء لمدة 20 دقيقة ، متبوعا بالتنظيف بالأرجون. أخيرا ، اغسل القارورة بالأرجون لمدة 10 ثوان وافصلها عن مشعب الفراغ. ضع القارورة على الثلج داخل صندوق القفازات.

في نافذة لوحة التحكم الخاصة ببرنامج التحكم في البيانات الاحترافية. حدد مصفوفة الصمام الثنائي للصور والمشغل الخارجي والمقياس اللوغاريتمي. قم أيضا بتشغيل برنامج عارض البيانات الاحترافي وحدد الدليل لتخزين ملفات البيانات.

الآن استبدل المحلول الموجود في محاقن الخزان C و F بمحلول فوسفات البوتاسيوم اللاهوائي 100 ملليمولار الرقم الهيدروجيني 7.5. أدر الصمامين C و F إلى موضع القيادة. انقر فوق إفراغ حقنة الإيقاف في برنامج التحكم في البيانات الاحترافية.

ثم ادفع المخزن المؤقت من حقن محرك الأقراص عبر دائرة التدفق عن طريق رفع ذاكرة الوصول العشوائي المقابلة يدويا. كرر التنظيف باستخدام محاقن الخزان C و F ثلاث مرات أخرى. لضمان الإزالة الكاملة للأكسيديز الجلوكوز من دائرة التدفق ، تابع النقر فوق خط الأساس في برنامج التحكم في البيانات الاحترافية.

استبدل محلول حقنة الخزان F بمحلول الإنزيم. أدر الصمام F إلى موضع القيادة. انقر فوق إفراغ حقنة الإيقاف في برنامج التحكم في البيانات الاحترافية.

ادفع محلول الإنزيم من حقنة محرك F عبر دائرة التدفق عن طريق رفع ذاكرة الوصول العشوائي المقابلة يدويا. ارجع إلى برنامج التحكم في البيانات الاحترافي لضبط وقت الاستحواذ على 60 ثانية. تحقق من أن كلا حقن محرك الأقراص ممتلئة بالحلول المقابلة لهما وأن وحدات قياس محرك الأقراص على اتصال بحقنة محرك الأقراص. المكابس.

أدر كلا الصمامين إلى موضع محرك الأقراص وانقر فوق الحصول في برنامج التحكم في البيانات الاحترافية لأداء محرك الأقراص. احصل على البيانات الطيفية للشكل المؤكسد للإنزيم في ثلاث نسخ باستخدام قيمة A 4 52 نانومتر التي تم الحصول عليها من محركات الأقراص. حدد تركيز الإنزيم قبل الخلط وقم بإعداد أربعة ملليلتر من محلول N-A-D-P-H.

1.5 أضعاف أكثر تركيزا حقنة خزان التعبئة C مع محلول N-A-D-P-H وأفرغ وأعد تعبئت حقنة الإيقاف ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. الآن ، احصل على أطياف أثناء تقليل محتويات تدفق الإنزيم من دائرة التدفق باستخدام الرقم الهيدروجيني اللاهوائي 100 مللي مولار لفوسفات البوتاسيوم 7.5. انقر الآن على خط الأساس في برنامج التحكم في البيانات الاحترافية.

ثم اخلطي 200 ميكرولتر من محلول مخزون الإنزيم مع 1000 ميكرولتر من محلول فوسفات البوتاسيوم اللاهوائي و 100 ملليمول. الرقم الهيدروجيني 7.5. استبدل محلول حقنة الخزان A بمحلول الإنزيم.

أدر الصمام A إلى موضع محرك الأقراص في برنامج التحكم في البيانات الاحترافي. انقر فوق حقنة الإيقاف فارغة. ادفع محلول الإنزيم من حقنة محرك الأقراص A عبر دائرة التدفق عن طريق رفع ذاكرة الوصول العشوائي المقابلة يدويا.

اضبط وقت التأخير على 0.5 ثانية ووقت الاستحواذ على 60 ثانية. تحقق من أن جميع محاقن محرك الأقراص مملوءة بالمحلول المقابلة لها وأن كبش محرك الأقراص على اتصال بمكابس حقنة محرك الأقراص. ثم أدر جميع صمامات محرك الأقراص إلى موضع محرك الأقراص وانقر فوق الحصول في برنامج التحكم في البيانات الاحترافي.

الحصول على البيانات الطيفية للشكل المؤكسد للإنزيم في ثلاث نسخ. بعد ذلك ، استبدل محلول حقنة الخزان B بمحلول N-A-D-P-H. 1.5 أضعاف أكثر تركيزا من محلول الإنزيم في المحقنة أ.أدر الصمام B إلى وضع محرك الأقراص وأفرغ وأعد ملء حقنة الإيقاف ثلاث مرات كما هو موضح سابقا في نافذة لوحة التحكم.

اضبط وقت التأخير على 0.5 ثانية. الاستحواذ في 20 ثانية ، استبدل محلول بحر حقنة الخزان بالمخزن المؤقت المؤكسج. أدر الصمام C إلى وضع القيادة.

امسح ثلاث مرات في برنامج التحكم في البيانات الاحترافي. اضبط وقت التأخير على 15 ثانية ووقت الاستحواذ على 900 ثانية. استمر في اكتساب الأطياف أثناء إعادة أكسدة الإنزيم المخفض بالكامل في أداة التدفق المتوقف.

يمكن مراقبة التخفيض اللاهوائي ل SID A مع N-A-D-P-H عن طريق قياس التغيرات في حالة الأكسدة والاختزال للفلافين باستخدام مادة ماصة عند 452 هنا. يتم تسجيل التغيرات الطيفية بمرور الوقت من SID المؤكسد A إلى الطيف الأخير من SID المخفض بالكامل A. يمكن تحديد معدل هذه الخطوة الأنزيمية من خلال ملاءمة البيانات مع المعادلة المناسبة. يمكن أيضا تحديد معدل الأكسدة ووسيطات التفاعل باستخدام وضع الخلط المزدوج للتدفق المتقطع في هذا التفاعل بواسطة AF Sid A. يتم اكتشاف C four A Hydroxi flavin الوسيط بوضوح مع لامدا بحد أقصى ثلاثة 80 نانومتر والإنزيم المؤكسد له لامدا بحد أقصى 450 نانومتر.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون أربع إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. تذكر أن تتأكد من أن الحلول لاهوائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقيق في كل من الأيون النسبي والتقرحي لتجربة أحادية مستقلة FLA مثل المادة الكيميائية السريعة.

يمكن أن يساعد كوينتين في توضيح الطبيعة المحزنة للوسطاء.