رصد انتقاصية ومؤكسد نصف ردود فعل من Monooxygenase فلافين التي تعتمد على استخدام توقف تدفق الطيفي

يستخدم هذا الإجراء جهاز التدفق الموقوف (stopped flow) للكشف عن الأشكال الطيفية المختلفة لإنزيم SID A وقياس المعدلات. يمكن تقسيم التفاعل الذي يحفزه SID A إلى نصف تفاعلات اختزالية وأكسدية لـ FAD. يرتبط الفلافين المؤكسد بـ N-A-D-P-H ويتفاعل لتكوين الفلافين المختزل و NADP، بالإضافة إلى أن تفاعل الأكسجين الجزيئي وارتباط الأورنيثين يؤدي إلى تكوين C four.

بعد عملية هيدروكسيلة الأورنيثين، يتكون الفلافين الهيدروكسيلي الذي يخضع بدوره لعملية نزع الماء لتشكيل الإنزيم المؤكسد. يظل NA DP plus مرتبطاً طوال الدورة التحفيزية، وهو آخر ركيزة يتم تحريرها. يسهل جهاز التدفق المتوقف الخلط السريع لأحجام صغيرة من المواد المتفاعلة وتسجيل النتائج.

يسمح قياس التغيرات الطيفية بمرور الوقت باستخدام مقياس الطيف الضوئي بقياس معدل تكوين واضمحلال التفاعلات التي يحفزها الإنزيم، وتحديداً الوسائط العابرة. ستقوم ريتا روبنسون وإنفيرو روميرو، عضوان في مختبري، بتوضيح هذه التجارب باستخدام المجموعة A مع إنزيم flavor mono oxygenase كنظام نموذجي. صب 250 milliliters من محلول potassium phosphate buffer بتركيز 100 millimolar في دورق بوخنر سعة 500 milliliters يحتوي على قضيب تحريك.

أغلق الدورق بسدادة مطاطية، ثم ضعه على لوح تحريك وقم بتوصيل الأنبوب القصير للدورق بخط شلينك (schlenk line). قم بإزالة الغازات من المحلول المنظم تحت تفريغ هوائي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التقليب، يليه الشطف بغاز argonne. كرر هذه العملية خمس مرات.

أخيرًا، قم بتطهير الدورق بغاز Argonne لمدة 10 ثوانٍ. افصل الدورق عن مجمع التفريغ وضعه داخل صندوق القفازات. استمر في التقليب بقوة والدورق مفتوح.

املأ محاقن الخزان بمحاليل جلوكوز أوكسيداز بتركيز 18.13 units per milliliter، ومحاليل جلوكوز بتركيز 100 millimolar. الآن، اضبط صمامات الدفع على وضع التحميل. املأ محاقن الدفع.

بعد ذلك، أدر الصمام F إلى وضع التشغيل. باستخدام برنامج التحكم في بيانات pro، انقر فوق "إفراغ محقنة الإيقاف"، ثم ادفع المحلول المنظم من محقنة التشغيل F عبر دائرة التدفق عن طريق رفع مكبس التشغيل المقابل يدويًا. استمر في القيام بذلك مع محاقن التشغيل الثلاث الأخرى، ثم اترك النظام ليتوازن لمدة ساعة.

قم الآن بإعادة ملء محاقن الخزان وتكرار عملية غسل نظام التدفق المتوقف. ولتحضير منظم pH مشبع بالأكسجين، قم بضخ فقاعات من أكسجين بتركيز 100% في المحلول لمدة ساعة واحدة مع التقليب.

بعد ذلك، أخرج الإبرة القصيرة من القارورة وانتظر لمدة 10 ثوانٍ. ثم قم بإزالة الإبرة الطويلة وضع القارورة المغلقة في صندوق القفازات. وذلك بالنسبة لمحلول N-A-D-P-H.

ضع أنبوب إينور سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مجم من N-A-D-P-H داخل صندوق القفازات. قم بإذابته في 300 µL من محلول منظم من فوسفات البوتاسيوم بتركيز 100 mM، لاهوائي، وبقيمة pH 7.5.

قم بسحب 30 µL لتحديد تركيز N-A-D-P-H. والآن، لإزالة الأكسجين من المخزون الإنزيمي، انقل المحلول إلى قارورة سعة 25 mL تحتوي على غطاء بقضيب تحريك وسدادة وختم من الألومنيوم. ثم ضع القارورة على الثلج.

قم بالتوصيل بخط شلينك (schlink line)، ثم قم بإزالة الغازات باستخدام التفريغ لمدة 20 دقيقة، يتبع ذلك الغسل بغاز argonne. أخيراً، قم بغسل القارورة بغاز Argonne لمدة 10 ثوانٍ وافصلها عن مجمع التفريغ. ضع القارورة على الثلج داخل صندوق القفازات.

في نافذة لوحة التحكم الخاصة ببرنامج pro data control، حدد photo diode array، والزناد الخارجي external trigger، والمقياس اللوغاريتمي logarithmic scale. قم أيضاً بتشغيل برنامج pro data viewer وتحديد المجلد المخصص لتخزين ملفات البيانات.

الآن استبدل المحلول في محاقن الخزان C و F بمحلول منظم فوسفات البوتاسيوم لاهوائي بتركيز 100 millimolar وبدرجة pH 7.5. أدر صمامي C و F إلى وضع التشغيل. انقر فوق تفريغ محقنة الإيقاف في برنامج التحكم في بيانات pro.

بعد ذلك، ادفع المحلول المنظم من كلتا حقنتي الدفع عبر دائرة التدفق عن طريق رفع مكبس الدفع المقابل يدويًا. كرر عملية الشطف باستخدام حقنتي الخزان C وF ثلاث مرات إضافية. ولضمان الإزالة الكاملة لـ glucose oxidase من دائرة التدفق، انتقل للنقر فوق baseline في برنامج pro data control.

استبدل المحلول الموجود في سرنجة الخزان F بمحلول الإنزيم. أدر الصمام F إلى وضع التشغيل. انقر فوق تفريغ سرنجة الإيقاف في برنامج التحكم في البيانات الاحترافية.

ادفع محلول الإنزيم من سرنجة الدفع F عبر دائرة التدفق عن طريق رفع مكبس الدفع المقابل يدويًا. عد إلى برنامج التحكم في بيانات pro لضبط وقت الاستحواذ على 60 ثانية. تحقق من ملء كلتا سرنجتي الدفع بالمحاليل المقابلة لهما ومن تلامس مكابس الدفع مع مكابس سرنجات الدفع.

أدر كلا الصمامين إلى وضع الدفع (drive) وانقر على "acquire" في برنامج التحكم في البيانات (pro data control software) لإجراء عملية الدفع. قم بجمع البيانات الطيفية للشكل المؤكسد من الإنزيم في ثلاث مكررات باستخدام قيمة A 4 52 nanometer التي تم الحصول عليها من عمليات الدفع. حدد تركيز الإنزيم قبل الخلط وقم بتحضير أربعة ملليلترات من محلول N-A-D-P-H.

املأ محقنة خزان التعبئة C بمحلول N-A-D-P-H بتركيز أكبر بمقدار 1.5 مرة، ثم قم بتفريغ وإعادة ملء محقنة الإيقاف ثلاث مرات كما هو موضح سابقاً. الآن، قم بالحصول على الأطياف أثناء اختزال الإنزيم، وقم بتطهير محتويات الدائرة التدفقية باستخدام محلول منظم من فوسفات البوتاسيوم بتركيز 100 millimolar وبقيمة pH 7.5 تحت ظروف لاهوائية. الآن، انقر فوق baseline في برنامج pro data control.

بعد ذلك، امزج 200 µL من محلول الإنزيم المركز مع 1000 µL من منظم فوسفات البوتاسيوم اللاهوائي بتركيز 100 mM، وبقيمة pH 7.5. استبدل المحلول الموجود في محقنة الخزان A بمحلول الإنزيم.

قم بتحويل الصمام A إلى وضع التشغيل (drive) في برنامج التحكم في البيانات الاحترافية. انقر فوق "إيقاف تفريغ المحقنة" (stop syringe empty). ادفع محلول الإنزيم من محقنة التشغيل A عبر دائرة التدفق عن طريق رفع مكبس التشغيل المقابل يدويًا.

اضبط وقت التأخير على 0.5 ثانية ووقت الحصول على البيانات على 60 ثانية. تحقق من أن جميع محاقن الدفع ممتلئة بالمحاليل المقابلة لها وأن مكابس الدفع ملامسة لمكابس محاقن الدفع. ثم أدر جميع صمامات الدفع إلى وضع الدفع وانقر على acquire في برنامج pro data control.

احصل على البيانات الطيفية للشكل المؤكسد من الإنزيم في ثلاث مكررات. بعد ذلك، استبدل المحلول الموجود في سرنجة الخزان B بمحلول N-A-D-P-H يكون تركيزه أعلى بمقدار 1.5 ضعف من تركيز محلول الإنزيم في السرنجة A. أدر الصمام B إلى وضع التشغيل (drive)، ثم قم بتفريغ وإعادة ملء سرنجة الإيقاف ثلاث مرات كما هو موضح سابقاً في نافذة لوحة التحكم.

اضبط وقت التأخير عند 0.5 ثوانٍ. وعند وصول عملية الحصول على البيانات إلى 20 ثانية، استبدل المحلول الموجود في سرنجة الخزان بالمحلول المنظم المؤكسج. أدر الصمام C إلى وضع التشغيل.

قم بعملية الشطف ثلاث مرات باستخدام برنامج التحكم في البيانات (pro data control software). اضبط وقت التأخير عند 15 ثانية ووقت الحصول على البيانات عند 900 ثانية. استمر في الحصول على الأطياف أثناء إعادة أكسدة الإنزيم المختزل بالكامل في جهاز التدفق المتوقف (stopped flow instrument).

يمكن مراقبة الاختزال اللاهوائي لـ SID A باستخدام N-A-D-P-H عن طريق قياس التغيرات في حالة الأكسدة والاختزال للفلافين باستخدام الامتصاص عند 452 نانومتر. يتم تسجيل التغيرات الطيفية بمرور الوقت من SID A المؤكسد وصولاً إلى الطيف الأخير لـ SID A المختزل تماماً. ويمكن تحديد معدل هذه الخطوة الإنزيمية عن طريق مطابقة البيانات مع المعادلة المناسبة. كما يمكن أيضاً تحديد معدل الأكسدة والوسطاء التفاعليين باستخدام وضع الخلط المزدوج لجهاز التدفق المتوقف في هذا التفاعل بواسطة AF Sid A. ويتم الكشف بوضوح عن وسيط C four A Hydroxi flavin بطول موجي أقصى (lambda max) يبلغ 380 نانومتر، بينما يمتلك الإنزيم المؤكسد طولاً موجياً أقصى (lambda max) يبلغ 450 نانومتر.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أربع إلى ست ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. تذكر التأكد من أن المحاليل لاهوائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استقصاء كل من الأيونات النسبية والتقرحية لـ FLA المستقلة أحادياً في تجارب لاحقة مثل الكيمياء السريعة.

يمكن لـ Quentin أن يساعد في توضيح الطبيعة الحزينة للمركبات الوسيطة.