إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا IPS بشرية عبر الإفراط في التعبير عن الفيروسات القهقرية بوساطة OCT four و SOX 2K LF four و M مع نظام مراسل GFP. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة الكمية المناسبة أولا من GFP الفردي الذي يعبر عن الفيروسات القهقرية. بعد ذلك ، يتم نقل الخلايا المصابة بالفيروس التي تعبر عن GFP إلى صفائح مغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ مع الخلايا الليفية الجنينية للفأر.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي استبدال الوسط بوسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. أخيرا ، يتم عزل مستعمرات IPS الصامتة GFP التي تظهر مورفولوجيا مشابهة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية. في النهاية ، تظهر النتائج التعبير عن العلامات متعددة القدرات الذاتية من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي و R-T-Q-P-C-R.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطريقة الحالية مثل تلطيخ نمط الحياة بعلامة السطح متعددة القدرات ومراقبة التغيير المورفولوجي هي جهاز iPad المرغوب فيه. يمكن عزل مستعمرات الخلايا بسهولة باستخدام فقدان تعبير GFP كعلامة للخلايا متعددة القدرات لبدء الزراعة. الخلايا الليفية البشرية في الخلايا الليفية المتوسطة قبل يوم واحد من لوحة العدوى ، مرة واحدة في 10 إلى خامس الخلايا الليفية البشرية في بئر واحد من ستة آبار صفيحة في اليوم التالي ، تستنشق الوسط لإزالة الخلايا الميتة وتضيف ملليلترين من وسط الخلايا الليفية الطازجة مع خمسة ميكروغرامات لكل مليلتر من كبريتات البروتامين.

ثم أضف بعناية الكمية المناسبة من كل فيروس يعبر عن GFP المقابلة لتعدد العدوى خمسة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها بعد يوم واحد من الإصابة. قم بإزالة الغسيل الطافي الفيروسي ثلاث مرات باستخدام ملليلترين PBS.

ثم أضف ملليلترين ، متوسطة الخلايا الليفية بعد ثلاثة أيام من الإصابة. تحقق من مضان GFP وقم بتجديد البئر بملليلتر. وسط الخلايا الليفية في اليوم التالي لوحة واحدة في 10 إلى الرابعة في السنتيمتر المربع من الفأر المشع أو الخلايا الليفية الجنينية أو الخلايا المغذية للميثامفيتامين في وسط الخلايا الليفية على طبق بتري 10 سم مغطى ب 0.1٪ جيلاتين.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، افصل الخلايا الليفية البشرية المصابة بمليلتر واحد من 0.05٪ تريبسن في EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية وجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 جم ، وقم بتعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسط الخلايا الليفية وأعد تشغيل الخلايا على جيلاتين 0.1٪ مغلف مسبقا باستخدام mfs. بعد 24 ساعة.

استبدل الوسيط بوسط ثقافة HESC وقم بتغيير الوسيط يوميا. ستبدأ مستعمرات ESC مثل المستعمرات في الظهور بعد 20 إلى 27 يوما من الإصابة بعد ظهور مستعمرات مثل ESC تحت المجهر الفلوري. تحقق من عدم وجود مضان GFP في مستعمرة تظهر مورفولوجيا مشابهة ل HSCs.

باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر. اختر مستعمرات IPSC الفردية وضعها في بئر واحد من 12 لوح بئر مغلف بالجيلاتين والميثامفيتامين واستكماله بوسط HESC. قم بتغيير المرور اليومي المتوسط للخلايا عن طريق غسل اللوحة بملليلتر واحد من DMM F 12.

ثم أضف 0.5 مل من الكولاجيناز واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. اغسل الخلايا مرتين باستخدام DM A MF 12. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من وسط HESC الطازج.

ثم استخدم رافع الخلايا لتفتيت المستعمرات إلى قطع صغيرة وفصل الخلايا المتبقية عن اللوحة. انقل القطع المعلقة من المستعمرات إلى بئر واحد من الجيلاتين وستة مطلية ب MEF. طبق جيد واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.

لفحص الخلايا عن طريق التألق المناعي. اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS وثبتها بنسبة 4٪ بارالديهايد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بتثبيتها باستخدام 0.2٪ tritton X 100 في PBS لمدة 30 دقيقة.

قم بحظر الارتباط غير المحدد عن طريق احتضان الخلايا بنسبة 3٪ BSA في PBS لمدة ساعتين. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بالجسم المضاد الأولي طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS واحتضانها بجسم مضاد ثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS أثناء الغسيل الأخير. يضاف الرقيق ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بتصوير الخلايا باستخدام مجهر الفلورسنت للوقت الفعلي الكمي.

يعزل تفاعل البوليميراز المتسلسل الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا الليفية البشرية المشتقة من الخلايا الليفية البشرية. استخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي. قم بتجميع أول حبلا (كدنا) باستخدام النسخ العكسي.

ثم استخدمه كقالب ل QPCR للكشف عن جينات متعددة القدرات. الخلايا الليفية البشرية ، BJ one التي أصيبت بمزيج من الفيروسات القهقرية التي تحمل OCT أربعة ، و SOX two ، و KLF four ، و Mick الموضحة هنا هي التغييرات المورفولوجية التي لوحظت أثناء إعادة البرمجة من اليوم الخامس. اليوم 10 و 14 و 21 ، تبدأ الخلايا في إظهار مورفولوجيا HESC الشبيهة بعد 21 يوما ، ويتم التعرف على IPCs بواسطة مضان GFP.

تعبر الخلايا الجذعية متعددة القدرات مثل الخلايا الجذعية الجذعية والخلايا الشاملة للفيروسات عن الآلية الجزيئية لقمع التعبير الجيني للفيروسات. ومع ذلك ، فإن ناقلات الفيروسات القهقرية المستخدمة هنا تعبر عن GFP جنبا إلى جنب مع إعادة برمجة الجينات بواسطة LTR الفيروسي القهقر. وبالتالي ، فإن الخلايا التي تعبر باستمرار عن GFP تعتبر تعبر عن الجينات المعدلة وراثيا دون إسكات الجينات الفيروسية كما هو موضح هنا بأمانة ، تظهر مستعمرات IPSC المعاد برمجتها التي تكتسب الشبكة الجزيئية متعددة القدرات غياب تعبير GFP.

يوضح هذا الشكل تحليل الكيمياء النسيجية المناعية للمستعمرات المشتقة من ديترويت 5 51 الخلايا الليفية مع الأجسام المضادة ل TRA 180 1 و TRA one 60 SSEA four T four و nano كما يمكن رؤيته بنجاح. تعبر IPCs المعاد برمجتها عن كل هذه العلامات. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء R-T-P-C-R الكمي لتحليل التعبير الجيني وكشف أن T four SOX two و KLF four M و nano قد زادت بشكل كبير مقارنة بخلايا الخلايا الليفية الأبوية ، ولكنها تتناسب مع تلك الموجودة في H تسعة HSCs.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصابة الفيروس ، وتحديد والتقاط خلايا IPA المبرمجة بالكامل باستخدام الفحص المجهري الفلوري.