مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

الهدف من هذه التجربة هو تحديد الجين أو الجينات المسؤولة عن السلامة المورفولوجية والوظيفية للعضيات النباتية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة سلفونات إثيل الميثان أولا كعامل كيميائي لبذور التأتب المطفرة التي تحمل علامة الفلورسنت العضية. الخطوة الثانية هي جمع البذور من النباتات الفردية من الجيل الأول من المطفرات لزراعة خطوط من الجيل المتحور اللاحق M الثاني.

بعد ذلك ، لوحظت مطفرات بذور إليانا باستخدام مجهر متحد البؤر أو فلورسنت لتحديد النمط الظاهري العضوي الشاذ. الخطوة الأخيرة هي توليد الجيل الثالث من المطفرات وتأكيد وجود النمط الظاهري المتحور. في النهاية ، يمكن تعيين الطفرة المتنحية باستخدام أدوات تسلسل الجيل التالي.

بمجرد تحديد موقع الجين المتحور ، يجب أن يعيد التحول مع الجين من النوع البري النمط الظاهري العضوي الشاذ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الحفاظ على السلامة المورفولوجية والوظيفية للعضيات النباتية. يؤدي الميثان أتيل ، ومعالجة السلفونات فوق بذور sta إلى تغييرات توقيت السيتوزين في الجينوم مما يؤدي إلى توقيت السيتوزين إلى التوقيت.

إضافة الطفرات. يعد علاج EMS خطوة أساسية في هذا البروتوكول لضمان طفرة نسبة مثالية داخل M شخصين. للبدء ، احصل على بذور نبات الأرابيدوبسيس من النوع البري كولومبيا Ecotype التي تم تصميمها مسبقا لتحمل علامة فلورسنت عضية ذات صلة.

انقل 0.8 جرام أو حوالي 40،000 بذرة إلى أنبوب صقر سعة 50 مل. ثم أضف 25 مل من الماء المقطر و 0.2٪ سلفونات إيثيل ميثان. احتضان الخليط لمدة 16 ساعة على خلاط متحور بسرعة منخفضة بعد الحضانة ، واستنشق السائل وتخلص منه في قفقة تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم المولاري.

لتعطيل EMS ، أضف 25 مل من الماء إلى أنبوب Falcon الذي يحتوي على البذور. أغلق الأنبوب واقلبه خمس مرات لغسل البذور. بعد أن تستقر جميع البذور ، استنشق الماء وتخلص منه في قارورة هيدروكسيد الصوديوم المولارية.

كرر خطوة الغسيل هذه حتى 10 مرات بعد الغسيل النهائي ، ينفق ريس البذور في الحد الأدنى من الماء. انتقل إلى تعقيم البذور بإضافة 25 مل من المبيض بنسبة 10٪ والرج بقوة لمدة 30 ثانية. بمجرد أن تستقر البذور في القاع ، اسكب المبيض واشطفه ب 25 مل من الماء المعقم.

بعد إزالة الماء المعقم ، أضف 25 مل من 70٪ من الإيثانول. رج الأنابيب لمدة 30 ثانية واترك البذور تستقر في القاع. اسكب الإيثانول واشطفه ب 25 مل من الماء المعقم.

كرر غسل الماء المعقم مرتين. ثم صب البذور على طبق بتري بلاستيكي يحتوي على ورق ترشيح ثلاثة مم. اترك البذور تجف تحت الغطاء بعد احتضان البذور لمدة يومين عند أربع درجات مئوية.

ضع البذور في طبق بتري 150 ملم بحوالي 250 إلى 300 بذرة لكل طبق في نصف ماجي ووسط سكوج يحتوي على هلام مقاتل. كعامل هلام ، قم بزراعة البذور من جيل M1 على أطباق لمدة أسبوعين. زرع الشتلات في التربة والسماح للنباتات بالاستمرار في النمو.

بعد 30 إلى 45 يوما ، ستصل النباتات إلى مرحلة النضج حيث تنضج ، لذلك يمكن رؤية التسريبات بوضوح. في هذه المرحلة ، اجمع M بذرتين من نباتات M1 الفردية لتوليد 1000 M خطين مستقلين. من أجل مراقبة الشتلات بمجهر متحد البؤر أو مضان ، قم بزراعة 60 بذرة من كل M اثنين من السطرين لمدة سبعة إلى 10 أيام على أطباق بتري البلاستيكية إلى النصف.

يزرع Moreish و scoog medium الذي يحتوي على جل مقاتل أيضا خمس شتلات من التحكم غير المعالج EMS على نفس اللوحة. بمجرد زراعة الشتلات ، قم بتركيب خمسة إلى 10 من الرصاص مع جانب ختم ABAC باتجاه العدسة 40 مرة على شريحة مجهرية ومحاطة بزلة غطاء تحت التألق ، وراقب كل أولين من المنطقة القشرية إلى المنطقة الإنسية لتغيير التوزيع الخلوي لعلامة العضية. بعد زرع النباتات الإيجابية في التربة وتنمو أن الشتلات كما هو موضح للتو ، تأكد من أن النمط الظاهري المتحور موجود في الجيل الثلاثة M.

قم بإزالة طفرات الخلفية الملوثة من خلال العبور الخلفي ثلاث مرات على الأقل إلى جينوم من النوع البري يحتوي على علامة الفلورسنت العضوية المطلوبة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لبدء رسم الخرائط ، استخدم مجموعة نباتات cogen DN Easy Z المصغرة لاستخراج ما يقرب من ثلاثة ميكروغرامات من الحمض النووي الجيني من M ثلاثة ، والذي يمثل الحمض النووي كولومبيا المتماثل اللواقح. أرسل هذا الحمض النووي لمحلل الجينوم Illumina اثنين من 14 تسلسل.

الخطوة التالية هي عبور زاغو المتحولة كولومبيا سوف لاس بيرغر لتوليد ذرية واحدة بعد التلقيح الذاتي الذي يمكن أن يحدث فيه التوليف. سينتج عن توليد الأسنان الصماء ويعمل في النهاية كرسم خرائط تحتوي على الجين محل الاهتمام ، والذي يسبب الطفرة. من خلال مقارنة الحمض النووي الجيني لهذه المجموعة مع الحمض النووي الجيني للنباتات من النوع الجيد ، يمكن تحديد موقع الطفرة في الجينوم.

بعد نمو النباتين F ، اجمع ما بين 70 و 100 F شخصين يظهران النمط الظاهري الشاذ ونفس العدد من النباتات F اثنين من النمط الظاهري من النوع البري ، وجمع قرص ورقة من كل نبات باستخدام لكمة كاملة. يجب جمع قرص الأوراق من أوراق من نفس العمر. لضمان كميات مماثلة من الحمض النووي ، يمكن معالجة العينات للاستخراج الجيني بشكل منفصل أو في مجموعات.

في هذه الحالة ، من الممكن جمع خمس إلى 10 عينات لكل أنبوب دائري بحيث يكون هناك عدد أقل من الأنابيب التي يجب استخراج الحمض النووي الجيني منها. استخدم مجموعة تنقية الحمض النووي لأوراق النبات النقية الرئيسية لاستخراج الحمض النووي الجيني. يمكن بعد ذلك قياس الحمض النووي الجيني الذي تم الحصول عليه من كل عينة باستخدام NanoDrop.

ثم الجمع بين كمية متساوية من الحمض النووي من كل عينة حتى إجمالي 300 نانوجرام مع الاحتفاظ بالعينات الطافرة والبرية منفصلة لعمل تفاعل الملصقات أولا ، أضف 60 ميكرولترا من محلول التمهيدي العشوائي 2.5 × و 42 ميكرولتر من الماء. بعد تغيير طبيعة الحمض النووي إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق ، قم باستدعاء العينات الموجودة على الجليد لتغيير طبيعة الحمض النووي. أضف 15 ميكرولترا من 10 × DN tps.

تخلط مع البيوتين DCTP وتكتمل بثلاثة ميكرولترات. جلين بوليميراز. احتضان العينات طوال الليل عند 25 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، أضف 15 ميكرولترا من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار و 400 ميكرولتر من الإيثانول البارد 100٪. احتضان العينات المختلطة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة بعد الطرد المركزي عند 20 ، 500 مرة جم لمدة 15 دقيقة. اغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من البرد ، 75٪ إيثانول بعد الدوران الثاني.

جفف حبيبات الحمض النووي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من الماء واستخدم خمسة ميكرولتر للتحقق من العائد والجودة على هلام حيوي. تم تحميل تفاعلات وضع العلامات العشوائية الرئيسية على هلام 1٪ من هلام أروس من مجموعة من النباتات البرية من النوع F من النباتات ومن مجموعة من النباتات المتحولة F اثنين.

كخطوة أخيرة ، أرسل 95 ميكرولترا من النوع البري وتفاعل وضع العلامات الطافرة لتصويب رقاقة الجينات وتهجين مصفوفة جينوم واحدة. بعد مسح الممحاة ضوئيا ، يتم تحليل ملفات CL النقطية الناتجة التي تم الحصول عليها باستخدام برنامجنا. بعد تثبيت برنامجنا ، افتح البرنامج والصق سلسلة الموصلات الحيوية الموجودة في الإجراء المكتوب.

ثم اضغط على مفتاح الإرجاع ، والذي سيقوم بتثبيت حزم BIOCONDUCTOR القياسية من موقع المصفوفة والتنميط الجيني ورسم الخرائط. قم بتنزيل الملفات المدرجة في النص وفك ضغطها في مجلد جديد على سطح المكتب. استمر في البيانات التي تم الحصول عليها من تجربة رقاقة الجينات في النوع البري C و L والمتحور C.الآن انسخ بيانات رقاقة الجينات للنوع البري C والمتحور C في المجلد.

بعد ذلك ، افتح R لجهاز كمبيوتر. انقر فوق ملف ثم انقر فوق تغيير الدليل. حدد المجلد الذي يحتوي على الملفات ، وانقر فوق مساحة عمل تحميل الملف ، ثم حدد A واحد V خمسة R افتح البيانات قراءة C do R باستخدام المفكرة وانسخ النص بالكامل إلى R لجهاز Mac ، انقر فوق mis ثم انقر فوق تغيير دليل العمل.

حدد المجلد الذي يحتوي على الملفات. انقر فوق ملف مساحة عمل تحميل مساحة العمل وحدد بيانات ATH one V five R. وبالمثل ، افتح كل من SFP R و MAP R باستخدام النص ، وقم بتحرير النص ونسخه إلى R في نافذة وحدة التحكم.

ستظهر رسالة للبحث عن الجينات في مورد معلومات نبات الأرابيدوبسيس أو TAIR. انسخ والصق الرابط الموجود في النص في متصفح الإنترنت. ستظهر نافذة وتطلب فتح الملف أو حفظه.

حدد حفظ. اختر اسم الملف وأرفق الامتداد. هل x ls.

ثم انقر فوق حفظ. تظهر هنا نتيجة نموذجية متوقعة. بعد تحليل البيانات التي تم الحصول عليها من رقاقة الجينات نبات الأرابيدوبسيس H مصفوفة جينوم واحدة ، يمثل هذا الشكل مثالا على رسم خرائط طفرة كولومبيا الصفرية باستخدام شريحة الجينات نبات الأرابيدوبسيس ، تهجين جينوم H واحد ، حيث تمثل الأشرطة الأفقية عتبات الكشف.

الطفرة في هذا المثال على الكروموسوم الأول ، محددة بقضبان رأسية. افتح ملف dot XLS للعثور على إحداثيات الطفرة داخل المنطقة المعينة. في قراءات Illumina المجمعة للجينوم المتحور ، حدد انتقالات EMS المحددة بين تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة.

بمجرد إتقان النهج الذي يصف هذا البروتوكول ، يمكن استخدامه لتعيين الجين لإطار زمني قصير بثلاثة مقارنة بطريقة رسم الخرائط الكلاسيكية.