Name: نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: اكتشف طريقة زراعة الأغشية الحيوية للمتفطرة السلية على واجهة الهواء والوسط، وتحديد تكرار البكتيريا المتكيفة مع الأدوية. تساعد هذه التقنية الباحثين على فهم آليات تحمل المضادات الحيوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تنفيذ العمل بدعم مالي من المعهد الوطني للصحة والجمعية الأمريكية لأمراض الرئة.

1. تزايد الأغشية الحيوية من M. مرض السل في زجاجة المسمار 250ml الاتحاد توج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الاعلام التحضير: ذوب 0.5g من KH 2 PO 4، 0.5g من MgSO 4، 4G من الهليونين-L، 2G من حامض الستريك، 0.05g من سيترات الأمونيوم الحديديك، 60mL من الجلسرين في 900mL من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم. الأوتوكلاف، باردة وفقط قبل بدء التجربة، إضافة ZnSO معقم 4 إلى تركيز النهائي من 0.1٪ ث / v منذ مولودية 2 7000 هو عوني التغذي بانتوثينات هذه السلالة يتطلب أيضا حامض البانتوثينيك في 10μg/mL من تركيز نهائي. </li></ol> ملاحظة: هذا هو تكوين معيار وسائل الإعلام Sauton لاستخدامها لمرض السل م. ومع ذلك، يمكن إذا لزم الأمر أيضا وسائل الإعلام المتخصصة الأخرى يمكن استخدامها للأنواع الأخرى بالمتفطرات. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللقاح إعداد: م. تنمو مرض السل في 7H9OADC مع 0.05٪ توين-80 لمدة أسبوع، أو OD 600 بنسبة 0.7 إلى 1.0. وطبقا لتقديراتويمكن استخدامها مباشرة كما lture اللقاح حتى التخفيف 1:100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن وسائل الإعلام 25mL Sauton لزجاجة المسمار البوليسترين توج 250ml الاتحاد (كورنينج). إضافة 250μl من اللقاح على المدى المتوسط، وكأب الزجاجة بإحكام جدا ووضعه دون عائق في حاضنة مرطب 37 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع. مراقبة زجاجة مرة واحدة كل يوم للتأكد من عدم وجود تلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الأسبوع الثالث، وتخفيف الحد الأقصى من القمقم للسماح للمزيد من النمو من م. مرض السل في واجهة. إذا لم يتم تخفيف الغطاء في هذه المرحلة ثم فإن تركيز الاكسجين في حاوية تؤخر تحقيق المزيد من النمو من البكتيريا. </li></ol> 2. نمو م. الأغشية الحيوية السل في 12-جيدا لوحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد وسائل الإعلام واللقاح من مولودية 2 7000 كما هو موضح في المقاطع A1 و A2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من وسائل الإعلام مع 60mL 600μl من اللقاح. الاستغناء 4.5mL من الخليط في كل بئر من لوحة. تغطية لوحة مع غطاء. التفاف لوحة عدة مرات مع parafilm. احتضان لوحة دون عائق في حاضنة مرطب على 37 درجة مئوية لمدة 5 أسابيع. </li></ol> 3. تحديد وتيرة صوامد المخدرات متسامح في م. السل الأغشية الحيوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو م. والأغشية الحيوية مرض السل في شكل 12-جيدا كما هو موضح في الفرع باء يستغرق ذلك ما مجموعه نحو أسبوعين-5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ونضجت الأغشية الحيوية (بعد 5 أسابيع من حضانة) حقن اختيارك للمضادات الحيوية في تركيز المطلوب في وسائل الاعلام تحت الأغشية الحيوية باستخدام microtip في ماصة. </li></ol> ملاحظة: إن حجم وسائل الاعلام تحت pellicles يقلل إلى حوالي 3.0mL. لذا يجب أن المحققين وفقا لذلك حساب كمية من المخدرات. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لوحة بلطف بحيث تنتشر تماما المضادات الحيوية على المدى المتوسط. لتحقيق نتائج يعتد بها إحصائيا، حقن عنتيبيأذني في أربعة آبار. في موازاة ذلك، حقن نفس الحجم من المذيب الذي تم حله في المضادات الحيوية في الآبار الأربعة الأخرى، وترك الماضي أربع آبار من لوحة لم يمسها. تغطية لوحة مع غطاء ووضع طبقات جديدة من parafilm حول اللوحة. وضعها مرة أخرى في الحاضنة لمدة الوقت المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الحضانة، وفتح لوحة وإضافة توين-80 للتركيز النهائي من 0.1٪ (حجم / حجم) في كل من الآبار. دوامة لوحة كاملة بلطف لتشتيت موحد للمنظفات. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. مزيج من كل محتوى جيد مع عدة مرات ماصة بحيث يمكن أن المحتوى كله بشكل موحد على نقل أنبوب مخروطي 15mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار على محتوى أنبوب في 4000rpm لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Resuspend لبيليه في 5ml من عازلة غسيل الطازجة (PBS مع الجلسرين بنسبة 10٪ و 0.05٪ توين-80). تكرار الغسيل ثلاث مرات. Resuspend لبيليه في 5ml من غسل العازلة. يبقيه على الكرسي الهزاز لسvernight في 4 درجات مئوية. </li></ol> ملاحظة: على الرغم من أن وضعت أصلا لدرجة حرارة منخفضة اللخنية M. (للحد من نموها خلال تشتت)، ويستخدم لمرض السل م وكذلك، لا يمكن على الأرجح الأنواع بطيئة النمو أن هزت في درجة حرارة الغرفة دون أي تأثير على النتيجة. يمكن أن تعصف في درجة حرارة الغرفة يكون ضروريا إذا كان يعمل في BSL-3 المرفق. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محقنة معقمة مزودة microtip (2-200μl) عن طريق خفض نهايته واسع إلى الحجم المناسب، من المناسب أن الحقنة والتغليف مع parafilm. تمرير مضمون كامل للأنبوب عن طريق حقنة طرف المجهزة، وجمع في أنابيب 1 15mL الطازجة. كرر هذه الخطوة 5 إلى 6 مرات حتى كنت مراقبة وقف متجانسة إلى حد ما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التخفيفات التسلسلي للتعليق على لوحة والتخفيفات في لوحة 7H11OADC لتحديد عدد من المستعمرات قابلة للتطبيق في كل بئر. احتضان لوحات لمدة ثلاثة أسابيع في الحاضنة 37 درجة مئوية. تحديد الترددقبرصي من صوامد في عدد السكان بيوفيلم عن طريق حساب نسبة من عدد من المستعمرات التي تم الحصول عليها في المضادات الحيوية المعالجة لتلك التي حصلنا عليها في مذيب لوحات المعالجة. </li></ol> 4. ممثل النتائج عندما تربيتها في زجاجة، والنمو من م. ويمكن رؤية مرض السل في قاعدة الزجاجة بحلول نهاية الأسبوع الأول. في نهاية الأسبوع الثاني، يمكن أن ينظر نمو غير مكتمل من البكتيريا في الهواء واجهة وسائل الإعلام، على الرغم من النمو في الهواء واجهة وسائل الإعلام مرئيا دائما في نهاية الأسبوع الثالث (الشكل 1A). في هذا الوقت لوحظ أيضا المرفق من البكتيريا على جدار الوعاء. من هذه النقطة وصاعدا نمو ثقافة يحدث في المقام الأول على واجهة الهواء وسائل الاعلام. السائل تحت سطح نمو واضح. عادة، وهيكل نضوج بحلول نهاية الأسبوع الخامس (الشكل 1B). إذا الحضانة لفترات طويلة، وسوف تبدأ في الهياكل تنزل الى قاع الإناء. يثير الاهتمام والفضول،تشديد الحد الأقصى حتى نهاية الأسبوع الثالث هو خطوة هامة في هذه العملية، وذلك لأسباب غير معروفة زجاجة فضفاض وتوج يؤخر بشكل كبير الشروع في النمو على واجهة 9. في شكل 12-جيدا، وينظر إلى بيوفيلم قوي في الهواء واجهة وسائل الإعلام في كل من الآبار في نهاية خمسة اسابيع (الشكل 2A). إذا لم يتم لف لوحات تماما بعد ذلك لوحظ الفرق نمو بيوفيلم. في أسوأ الحالات، يمكن أن مهمة وسائل الإعلام تبخر المماطلة في نمو البكتيريا (الشكل 2B). وبالتالي، التفاف من لوحة من الضروري على حد سواء لمنع التبخر وكذلك لتوفير البيئة لتشكيل بيوفيلم (انظر الفقرة السابقة). عدد عصيات قادرة على البقاء في الأغشية الحيوية يحدد مع هذا الأسلوب هو تكرار للغاية. استجابة من M. السل الأغشية الحيوية يختلف مع طبيعة من المضادات الحيوية. للحصول على المضادات الحيوية للجراثيم مثل الريفامبيسين، وفقدان القدرة على الاستمرار في أعقاب bipha<html> كذا اتجاه 9. الانحدار السريع في جدوى خلال الأيام الثلاثة أو الأربعة الأولى، تليها مرحلة المستمرة التي نسبة مئوية صغيرة من السكان ما زالت المتمردة تماما للمضادات الحيوية بغض النظر عن تركيز المضادات الحيوية أو وقت التعرض. ويبين الشكل 3 عدد عصيات قادرة على البقاء في الأغشية الحيوية ناضجة بعد التعرض لمدة 7 أيام على 50μg/mL (50 مرات أعلى من MIC) من الريفامبيسين. <img alt="رقم 1A." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> رقم 1A. ظهور في وقت مبكر من م. عصيات السل في الهواء واجهة وسائل الإعلام من البكتيريا بعد 3 أسابيع من الحضانة. <img alt="الشكل 1B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> نضجت الشكل 1B. الأغشية الحيوية من م. مرض السل في الهواء واجهة وسائل الإعلام بعد خمسة أسابيع من الحضانة. 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; 2A الرقم 5 أسابيع الأغشية الحيوية القديمة م. السل نمت في شكل جيد 12. <img alt="الرقم 2B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> 2B شخصية. محاولة فاشلة لتنمو M. ​​الأغشية الحيوية السل في 12 لوحة من دون parafilm جيدا. <img alt="الشكل 3." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> الشكل 3. مؤامرة ممثل تبين تواتر صوامد المخدرات متسامح في م. السل الأغشية الحيوية التي تزرع في 12-جيدا شكل والمعرضين لل50μg/mL من الريفامبيسين لمدة سبعة أيام.

<ol><li>Saltini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+and+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis.</a> Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+dispersal+and+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens.</a> Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).</li>
<li>Henke, J. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+social+engagements%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial social engagements.</a> Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).</li>
<li>Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all+and+all+for+one%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One for all and all for one.</a> Science. 280, 226-227 (1998).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Ojha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GroEL1%3A+a+dedicated+chaperone+involved+in+mycolic+acid+biosynthesis+during+biofilm+formation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria.</a> Cell. 123, 861-873 (2005).</li>
<li>Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).</li>
<li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).</li>
<li>Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+tuberculosis+incidence+and+their+determinants+in+134+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries.</a> Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).</li>
<li>Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+and+sterilizing+activities+of+antituberculosis+drugs+during+the+first+14+days%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).</li>
<li>Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biofilm+formation+by+clinical+isolates+of+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium.</a> J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+rapidly+growing+mycobacterial+species+Mycobacterium+fortuitum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum.</a> FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+regulation+of+mycolic+acid+cyclopropanation+in+saprophytic+mycobacteria%3A+role+of+the+Mycobacterium+smegmatis+1351+gene+%28MSMEG_1351%29+in+CIS-cyclopropanation+of+alpha-mycolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates.</a> J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).</li>
</ol>

ليس لدينا ما يكشف.

الدرن (السل)، والناجمة عن الإصابة بمرض السل المتفطرة، لا يزال يشكل خطرا كبيرا على الصحة العامة العالمية. وتشير التقديرات إلى ما يقرب من ثلث سكان العالم مصابون بهذا المرض asymptomatically من قبل الممرض، ونحو 9 ملايين حالة جديدة تظهر في عيادة في كل عام مع أعراض مرض السل النشط، ونحو 1.7 مليون يموتون من هذا المرض كل عام 11. وساهم في المقام الأول من عبء كبير للمرض عن طريق عدم وجود لقاح، والعلاج الكيميائي بالغة التعقيد الذي ينطوي على نظام للأدوية المتعددة تدار على مد...

<table><tbody><tr><td>حضّانة</td><td>VWR international</td><td>Model # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>زجاجات مستنبتات من البولي ستيرين</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>أطباق زراعة أنسجة ذات 12 بئرًا</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب مخروطية سعة 50-mL</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>هزاز (Rocker)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>ثلاجة كروماتوغرافية</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>طبق بتري</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (أحادي القاعدة)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>حمض الستريك</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>سترات أمونيوم الحديديك</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>جليسرول</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-pantothenic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>مرق Difco Middlebrook 7H9</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>مكمل Middlebrook OADC</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>زجاجة تخزين سعة 250mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>أطباق ذات 12 بئرًا</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>ريفامبيسين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>ميثانول</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>سرنجة 10mlL</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>رؤوس ماصات 1-200&amp;mu;L</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>بارافيلم M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب طرد مركزي سعة 15mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>آجار Difco Mycobacteria 7H11</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (ثنائي القاعدة)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

المتفطرة السلية، وكيل خاص بأسباب الأمراض من مرض السل البشري، لديه قدرة غير عادية على البقاء على قيد الحياة ضد الضغوط البيئية بما فيها المضادات الحيوية. على الرغم من تحمل الإجهاد من م. مرض السل هو واحد من المساهمين على الأرجح إلى العلاج الكيميائي لمدة 6 أشهر طويلة من مرض السل 1، والآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا النمط الظاهري مميزة من مسببات المرض لا تزال غير واضحة. لقد تطورت الأنواع الجرثومية العديد من البقاء على قيد الحياة في البيئات المجهدة عن طريق تجميع الذاتي في السطح، ودرجة عالية من التنظيم المرفقة، وهياكل مصفوفة مغلفة تسمى الأغشية الحيوية 2-4. النمو في المجتمعات ويبدو أن استراتيجية البقاء على قيد الحياة المفضل للميكروبات، ويتحقق من خلال المكونات الجينية التي تنظم مرفق السطح، والاتصالات بين الخلايا، وتجميع المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) 5،6. ومما يسهل على الأرجح إلى التسامح الإجهاد البيئي من قبل العائد على السهم، وربما من قبل physiological التكيف من عصيات الفردية لmicroenvironments غير متجانسة ضمن بنية معقدة من الأغشية الحيوية 7. في سلسلة من الأوراق الأخيرة التي أنشأنا م. والسل، واللخنية المتفطرة لديها ميل قوي للنمو في هياكل متعددة الخلايا المنظمة، ودعا الأغشية الحيوية، والتي يمكن أن تحمل أكثر من 50 أضعاف الحد الأدنى من تركيز المثبطة من الأدوية المضادة للسل الإيزونيازيد والريفامبيسين 8-10. م. مرض السل، ولكن يتطلب يثير الاهتمام والفضول شروط محددة لتشكيل الأغشية الحيوية الناضجة، في نسبة معينة من فراغ الرأس 9:01: وسائل الإعلام، فضلا عن تبادل محدود من الهواء مع الغلاف الجوي 9. ربما يمكن أن متطلبات الظروف البيئية المتخصصة أن ترتبط إلى حقيقة أن م. مرض السل هو الممرض تلزم الإنسان، وبالتالي تكيفت مع البيئات الأنسجة. في هذا المنشور نظهر طرق زراعة M. مرض السلالأغشية الحيوية في زجاجة، وشكل لوحة 12-جيد، وهو مناسب للدراسات البكتريولوجية وكذلك الوراثية. وقد وصفت نحن على بروتوكول لسلالة ضعيفة من م. والسل، ومولودية 2 7000، مع الحذف في مواضع اثنين، panCD وRD1، التي تعتبر بالغة الأهمية للنمو في الجسم الحي من 9 الممرض. ويمكن استخدامها بأمان هذه السلالة في احتواء BSL-2 لفهم البيولوجيا الأساسية للمرض السل الممرض وبالتالي تجنب شرط وجود مرفق BSL-3 باهظة الثمن. ويمكن تمديد هذا الأسلوب، بعد إجراء التعديلات المناسبة في وسائل الإعلام، أن ينمو بيوفيلم من الأنواع الأخرى بالمتفطرات زروع. وعموما، فإن بروتوكول موحد للاستزراع الأغشية الحيوية بالمتفطرات مساعدة المحققين المهتمين بدراسة الخصائص الأساسية مرونة من متفطرات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن طريقة واضحة وموجزة من الأغشية الحيوية بالمتفطرات متزايد يساعد أيضا في الجرد السريرية والدوائيةestigators لاختبار مدى فعالية دواء المحتملة.

المتفطرة السلية تشكل الأغشية الحيوية المخدرات متسامح عندما تربيتها في ظروف معينة. نحن هنا وصف أساليب لزراعة M. الأغشية الحيوية والسل، وتحديد وتيرة صوامد المخدرات متسامح. وهذه البروتوكولات أن تكون مفيدة لمزيد من الدراسات في آليات التسامح المخدرات في م. مرض السل.

تمتلك بكتيريا المتفطرة السلية (Mycobacterium tuberculosis)، وهي العامل المسبب لمرض السل البشري، قدرة استثنائية على البقاء في مواجهة الضغوط البيئية، بما في ذلك...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح طريقة تنمية الغشاء الحيوي لبكتيريا m tuberculosis على الواجهة البينية بين الهواء والوسط الغذائي، وتحديد تكرار الخلايا الأساسية المقاومة للأدوية في هذه الأغشية الحيوية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير الأوساط الغذائية واللقاحات المناسبة. وتتمثل الخطوة الثانية في تنمية الأغشية الحيوية لبكتيريا m tuberculosis في أطباق 12 well plates.بعد ذلك، يُضاف مضاد حيوي اختباري بتركيز مطلوب، ويتم تحديد تكرار الخلايا المستمرة المتحملة للعقار. وفي حالة بكتيريا M tuberculosis، يمكن تحديد الأغشية الحيوية. وفي النهاية، يمكن استغلال هذه التقنية للمساعدة في فهم أساس تطور الغشاء الحيوي وفك رموز آليات تحمل العقاقير في M tuberculosis. وتتمثل الميزة الرئيسية لزراعة الغشاء الحيوي لبكتيريا M tuberculosis مختبرياً في أوساط خالية من المنظفات في أن النمو التلقائي للبنية المعقدة متعددة الخلايا في الخط القاعدي يكشف عن خصائص فريدة للكائن الحي لا تظهر في المزارع السائلة.وتشمل هذه العمليات الالتصاق بالسطح، والتفاعلات بين الخلايا، وتخليق المصفوفة المساعدة، والتكيف الفسيولوجي ضمن البيئة الدقيقة غير المتجانسة لهذا التركيب. ومن الأهمية بمكان أن هذه المعلومات ستكون ذات صلة وثيقة بفهم أساس استمرار *M tuberculosis* في منافذ متخصصة معينة مثل الفجوات، حيث من المرجح أن يحدث نمو غزير للبكتيريا في بيئة مساعدة ضمن تراكيب متعددة الخلايا. وتمتد آثار هذه التقنية نحو تقصير مدة علاج السل، لأن تحديد واستهداف العوامل المرتبطة بالأغشية الحيوية قد يقلل من تكرار وجود المجموعات الفرعية المتحملة للعقاقير داخل هذه الأغشية الحيوية.في هذا البروتوكول، يتم استخدام تركيبة قياسية من أوساط soans لزراعة M tuberculosis. ومع ذلك، عند تنمية الأغشية الحيوية لأنواع أخرى من المتفطرات، استخدم الأوساط المتخصصة المناسبة لها، ثم قم بتحضير اللقاحات الأولية لـ M tuberculosis في زجاجات بلاستيكية سعة 125 milliliter تحتوي على 15 milliliters من الوسط السائل.بين 80 نموًا. تُحضن المزارع تحت ظروف قياسية حتى تصبح قيمة الكثافة الضوئية OD 600 ما بين 0.7 و 1.0، وهو ما يستغرق حوالي أسبوع. وعندما تصل المزرعة إلى هذه الكثافة، يمكن استخدامها مباشرة كلقاح بتخفيف بنسبة 1 إلى 100. بعد تحضير اللقاح، أضف 600 µL إلى 60 mL من وسط sawtons.بعد خلط اللقاح برفق في الوسط الغذائي، وزع 4.5 milliliters من المزيج في كل بئر من أطباق ذات 12 بئراً، ثم غطِّ الطبق ولفه عدة مرات بورق البارافيلم (para film). بعد ذلك، قم بتحضين الطبق في حضانة رطبة عند 37 degrees Celsius.بعد مرور خمسة أسابيع من النمو دون مقاطعة، ابدأ باختبار الخلايا المستمرة المتحملة للعقار. بعد خمسة أسابيع من النضج، سينخفض حجم الوسط إلى حوالي ثلاثة ملليلتر لكل بئر في أربعة آبار. احقن المضاد الحيوي المطلوب مباشرة تحت الغشاء الحيوي الرقيق الموجود على الوسط.يجب حقن أربعة آبار أخرى بالمذيب وحده، وترك الآبار الأربعة الأخيرة دون حقن. يوفر هذا قوة إحصائية وعناصر تحكم مناسبة؛ قم بهز الطبق بلطف لضمان انتشار المضاد الحيوي تماماً في الأوساط الزرعية. الآن، قم بتغطية الطبق.ضع طبقات جديدة من البارافورم حول الطبق، ثم قم بتحضين الطبق لمدة تتراوح من يوم واحد إلى سبعة أيام وفقاً للتجربة. في نهاية فترة التحضين، أضف tween 80 إلى كل بئر، ثم هز الطبق بالكامل برفق لتوزيع المنظف بشكل متجانس.ثم يتم تحضين الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، استخدم الماصة لخلط محتوى كل بئر حتى يصبح متجانساً. ثم انقل المزرعة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.قم بطرد الأنبوب المخروطي مركزياً، ثم أعد تعليق الراسب. علّق الراسب في خمسة مليلترات من محلول الغسل المنظم الطازج، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى وأعد التعليق. كرر عملية تعليق الخلايا في محلول الغسل المنظم ثلاث مرات إضافية.بعد ذلك، تُحفظ الخلايا في محلول الغسيل طوال الليل على جهاز هزاز (rocker) في غرفة باردة. وعلى الرغم من أن درجة الحرارة المنخفضة قد تم تطويرها في الأصل لـ EMS magmatic لتقليل نموها أثناء التشتيت وللاستخدام مع M tuberculosis أيضًا، إلا أنه يمكن على الأرجح هز الأنواع بطيئة النمو في درجة حرارة الغرفة دون أي تأثير على النتائج.قد يكون الهز في درجة حرارة الغرفة ضرورياً في حال العمل في مرفق من المستوى الثالث للسلامة البيولوجية (BSL 3). في اليوم التالي، جهز حقنة للتجانس والنقل. لكل معلق، قم بتركيب رأس ماصة دقيقة في حقنة معقمة. قص الطرف العريض من الرأس ليتناسب مع الحجم، ثم ثبته في الحقنة، ولف نقطة الاتصال بشريط بارافيلم (para film).مرر معلق الخلايا المبرد عبر المحقنة المزودة بالطرف، ثم أفرغ المحتوى في أنبوب مخروطي نظيف سعة 15 milliliter. كرر هذه الخطوة من خمس إلى ست مرات مع استبدال الأنبوب باستمرار حتى يبدو المعلق متجانساً للغاية. الآن، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية لكل معلق، وازرع كل تخفيف على طبق أغار.بعد تحضين الأطباق لمدة ثلاثة أسابيع، حدد تردد الخلايا المستمرة في مجتمع الغشاء الحيوي من خلال مقارنة أعداد المستعمرات في الأطباق المعالجة بالمضاد الحيوي والأطباق الضابطة. عند الزراعة في زجاجة، نمت بكتيريا M tuberculosis في قاعدة الزجاجة خلال الأسبوع الأول.بحلول نهاية الأسبوع الثاني، لوحظ نمو بقعي للبكتيريا عند السطح الفاصل بين الهواء والوسط الغذائي، والذي أصبح أكثر وضوحاً بنهاية الأسبوع الثالث. كما لوحظ التصاق البكتيريا بجدار الوعاء، وكان نمو المزرعة يحدث بشكل أساسي عند السطح الفاصل بين الهواء والوسط الغذائي. وكان السائل الموجود تحت منطقة النمو السطحية صافياً.بحلول نهاية الأسبوع الخامس، نضج التركيب بشكل كامل. وفي تنسيق يحتوي على 12 بئراً بعد خمسة أسابيع من الحضن، لوحظ وجود غشاء حيوي قوي عند الواجهة بين الهواء والوسط في كل بئر في الأطباق التي لم تكن مغلفة بالكامل. كما لوحظ نمو تبايني للغشاء الحيوي بالإضافة إلى تبخر ملحوظ في الوسط.توقف النمو البكتيري على هذه الأطباق. كانت عدد البكتيريا العصوية القابلة للحياة في الغشاوات الحيوية قابلة للتكرار بشكل كبير، وتفاوتت بتفاوت المضادات الحيوية المختلفة. فعلى سبيل المثال، في حالة الريفامبيسين، وهو مضاد حيوي قاتل للبكتيريا، حدث انخفاض سريع في الحيوية خلال الأيام الثلاثة أو الأربعة الأولى، أعقبته مرحلة ثبات بقيت فيها نسبة صغيرة من المجتمع البكتيري مقاومة تماماً للمضادات الحيوية، بغض النظر عن تركيز المضاد الحيوي أو مدة التعرض له.يمكن استخدام الإجراء ذاته في فحص الطفرات من أجل تحديد الجينات المشاركة في ارتباط Mycobacterium tuberculosis بسطح الغشاء الحيوي (biofilm)، ونمو البكتيريا على الواجهة، ونضج الـ Pecos. لا تنسَ أن العمل مع M tuberculosis يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل استخدام مرافق احتواء من المستوى الثالث للسلامة البيولوجية (biosafety level three) أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

growth-of-mycobacterium-tuberculosis-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

هذه الورقة توضح أساليب مختلفة من...

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

ويصف وسائل الفحص السريع لقياس وقت مبكر تشكيل بيوفيلم في البكتيريا والفطريات. يستخدم هذا الأسلوب لوحة microtiter كما التحتية لتشكيل بيوفيلم الميكروبية ، وبيوفيلم هو تصور استخدام الكريستال سلالة البنفسجي. في مقايسة يوفر إما فحص نوعي أو كمي لتشكيل بيوفيلم في وقت مبكر.

Microtiter تشكيل بيوفيلم الطبق الفحص

توضح هذه المقالة إجراءات لتشكيل والتصور لبيوفيلم البكتيريا نما داخل الشريحة الغرفة 8...

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

وعموما الأغشية الحيوية الميكروبية التي تشكلها مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا المتخصصة. وحيد الخلية تحليل هذه القطعان يتطلب استخدام للصحفيين فلوري. نحن هنا وصف بروتوكول لتصور ورصد عدة...

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

توضح هذه المقالة الفيديو خط أنابيب الإنتاجية العالية التي أنشئت بنجاح لتصيب وتحليل أعداد كبيرة من الأجنة الزرد توفير أداة قوية جديدة لاختبار المركب واكتشاف المخدرات باستخدام كله كائن فقاري الحيوان.

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

يصف هذا البروتوكول تصور تطور الأغشية الحيوية بعد التعرض لعوامل المضيف باستخدام نموذج غرفة الشريحة. يسمح هذا النموذج بالتصور المباشر لتطوير الأغشية الحيوية بالإضافة إلى تحليل معلمات الأغشية الحيوية باستخدام برامج الكمبيوتر.

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

يقدم هذا البروتوكول منهجية لإجراء نمو الأغشية الحيوية وقياسات الكتلة الحيوية باستخدام أجهزة لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل العميق للبئر المجمعة ذاتيا لفحص الأغشية الحيوية الثابتة ذات الغطاء المربوط جيدا بإنتاجية عالية 96 جيدا.

توليد كتلة حيوية أكبر من الأغشية الحيوية البكتيرية باستخدام أجهزة الصفائح الدقيقة العميقة للوحة PCR

يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لتطوير الأغشية الحيوية الحبيبية. هذه الطريقة قابلة للتطوير لأحجام الثقافة المختلفة ، مما يسمح بسهولة اعتمادها لأهداف تجريبية مختلفة. يتيح تصميم الطريقة التقييم النوعي أو الكمي لإمكانية تكوين الأغشية الحيوية للعديد من الأنواع المتفطرة.

تزايد الأغشية الحيوية المتفطرة كنموذج لدراسة مقاومة مضادات الميكروبات

تسمح هذه المنهجية بإنشاء نموذج غشاء حيوي متعدد الميكروبات في التليف الكيسي لاختبار حساسية مضادات الميكروبات في المختبرات البحثية والسريرية. يوفر هذا النموذج نتائج دقيقة وموثوقة على مجموعة من المخرجات.

تطوير نموذج الأغشية الحيوية للمستعمرة متعددة الميكروبات لاختبار مضادات الميكروبات في التليف الكيسي

تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا ل PmbExM ، وهي تقنية مجهرية تمدعية مصممة خصيصا للأغشية الحيوية Proteus mirabilis . يستخدم PmbExM معالجة إنزيمية تدريجية لعينات الأغشية الحيوية لتحقيق توسع متناحي بمقدار 4.3 أضعاف ، مما يتيح تحليلا فائق الدقة للتنظيم المكاني للهياكل الخلوية وتحت الخلوية داخل هذه المجتمعات الميكروبية اللاطئة.

التصوير فائق الدقة للفيلم الحيوي Proteus mirabilis بواسطة الفحص المجهري التوسعي

اكتشف طريقة زراعة الأغشية الحيوية للمتفطرة السلية على واجهة الهواء والوسط، وتحديد تكرار البكتيريا المتكيفة مع الأدوية. تساعد هذه التقنية الباحثين على فهم آليات تحمل المضادات الحيوية.

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

استكشف المزيد من الفيديوهات