قياس نشاط V عامل في البلازما البشرية باستخدام الفحص التخثر صفيحة ميكروسكوبية

الهدف العام من الإجراء التالي هو تطوير اختبار صفيحة دقيقة يقيس نشاط عامل بروتين التخثر V أثناء تكوين جلطة فيبرين في البلازما البشرية. استجابة للإصابة ، يتم تنشيط عملية تخثر الدم وينتج عنها سلسلة من تفاعلات تحويل زيموجين للبروتياز التي تؤدي في النهاية إلى توليد إنزيم التخثر الثرومبين ، ويقوم الثرومبين بتجميع الفيبرينوجين القابل للذوبان إلى مونومرات الفيبرين ، والتي ترتبط بعد ذلك لتشكيل جلطة فيبرين غير قابلة للذوبان. عادة ، يظل الدم كسائل يتدفق بحرية أثناء الحالة الصحية أو غير المصابة ، وكمية الفيبرين المتكونة تساوي كمية الفيبرين المتدهورة أو المكسورة.

ومع ذلك ، في بعض الحالات المرضية ، يؤدي التخثر المفرط إلى أمراض القلب والسكتة الدماغية ، في حين أن قلة التخثر تؤدي إلى ميول النزيف ، والتي غالبا ما تظهر في الهيموفيليا. العامل الخامس هو بروتين في البلازما في شكله المنشط خمسة أ هو مسرع حاسم لتوليد الثرومبين أثناء تكوين جلطة الفيبرين كجزء من مركب إنزيم البروثرومبين ، ويتكون البروثرومبين من أربعة مكونات العامل 10 أ ، وعامل البروتياز خمسة أ ، والدهون ذات العامل المساعد ، والسطح والكالسيوم. يزيد عامل الملين خمسة أ من الكفاءة التحفيزية أو kcat للعامل 10 أ نحو ركيزته البروثرومبين بحوالي 3000 ضعف ، مما يعزز بشكل عميق توليد الثرومبين وتكوين جلطة الفيبرين.

يفضل استخدام منصة الصفيحة الدقيقة لقياس الأحداث المحفزة للإنزيم بسبب الراحة وتكلفة الوقت وأحجام العينات الصغيرة والمراقبة المستمرة والإنتاجية العالية. يمكن مراقبة حدث تكوين جلطة الفيبرين باستخدام قارئ صفيحة دقيقة عن طريق قياس الزيادة في امتصاص الضوء للبلازما لأنها تتغير من مظهر أصفر شفاف مع عدم وجود جلطة فيبرين والحد الأدنى من امتصاص الضوء إلى مظهر غائم معتم مع جلطة فيبرين وأقصى امتصاص للضوء. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل فحوصات أنبوب الإمالة اليدوي أو المقايسات باستخدام أجهزة التحليل الآلية في أن الطريقة سريعة وغير مكلفة ولها متطلبات حجم عينة صغيرة وإنتاجية عالية.

يقيس الاختبار نشاط العامل الخامس الذي تم تنشيطه عن غير قصد وتنشيط الثرومبين للحصول على تقييم كمي كامل لنشاطه الوظيفي الكلي. سيظهر هذه التقنية ديريك تيلي ، طالب الماجستير في المختبر. من أجل قياس نشاط العامل الخامس في عينة البلازما ، من الضروري بناء نشاط العامل الخامس في مرحلة واحدة ، والمنحنيات القياسية لوقت تكوين جلطة الفيبرين في اللوحة A والمعدل الأولي لتكوين جلطة الفيبرين في اللوحة B باستخدام البلازما البشرية العادية أو NHP كمعيار يحتوي بحكم التعريف على وحدة واحدة من العامل خمسة النشاط لكل مل ذوبان الجليد في البلازما الناقصة للعامل الخامس ، البلازما البشرية الطبيعية ، وعينة من البلازما المجهولة والثرومبوبلاستين عند 37 درجة لمدة 10 دقائق.

امزج برفق نقل البلازما ونقص الجلطة برفق لفصل صواني الغسيل البلاستيكية واحتضانها على الثلج. قم بتخزين البلازما البشرية الطبيعية وأخذ عينات من البلازما المجهولة على الجليد بعد الخلط بلطف. قم بتخزين كلوريد الكالسيوم 25 ملليمولار في الماء المقطر في صينية غسيل منفصلة في درجة حرارة الغرفة للمنحنيات القياسية لنشاط العامل الخامس واحد.

قم بإعداد 200 ميكرولتر لكل من التخفيف التسلسلي المزدوج للبلازما البشرية الطبيعية من 0 2 4 8 16 32 64 و 1 28 و 2 56 و 512 أضعاف في HBS pH 7.4 باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل ، وبئر الدوامة واحتضانها على الجليد. بالنسبة لعينة البلازما المجهولة ، قم بإعداد 200 ميكرولتر لكل منها 40 ضعفا من البلازما البشرية الطبيعية وعينة البلازما غير المعروفة في HBS pH 7.4 باستخدام أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. ضع خمسة شرائح ميكروويل في حامل القالب الخاص بقارئ الصفيحة الدقيقة.

قم بتشغيل قارئ Microplate والوصول إلى برنامج تطبيق Microplate Softmax Pro باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بإجراء إضافات متزامنة بمقدار 50 ميكرولترا من البلازما الناقصة بالعامل الخامس إلى جميع عينات الآبار الدقيقة باستخدام ماصة واحدة وأضف 50 ميكرولترا من التخفيفات التسلسلية ال 10 المحضرة للبلازما البشرية العادية و 40 ضعفا من البلازما البشرية العادية وعينة من البلازما المجهولة لفصل آبار MICROPLATE باستخدام ماصة متعددة القنوات ، وأضف 50 ميكرولترا من رأب الخثرة إلى جميع آبار العينات. احتضن في قارئ Microplate عند 25 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة مع الاهتزاز خلال 15 إلى 25 ثانية من الحضانة لمدة دقيقة واحدة.

باستخدام الكمبيوتر المتصل بقارئ MICROPLATE ، قم بالوصول إلى برنامج تطبيق Softmax Pro Microplate. اضبط قارئ الصفيحة الدقيقة على الطول الموجي للامتصاص على وضع 405 نانومتر إلى درجة الحرارة الحركية إلى 25 درجة مئوية وقم ببرمجة قارئ الصفيحة الدقيقة للاهتزاز خلال الثواني الخمس الأولى بعد إضافة كلوريد الكالسيوم وقياس الامتصاص عند 405 نانومتر كل خمس ثوان لمدة ست دقائق. بعد ذلك، لا يتم تضمين فترة الاهتزاز البالغة خمس ثوان في أوقات الجلطة المحسوبة باستخدام ماصتين متعددي القنوات في وقت واحد لإضافة 50 ميكرولترا من كلوريد الكالسيوم إلى شريطي الصفيحة الدقيقة مع العينات.

انتظر 15 ثانية واضغط على الفور على أيقونة البدء في Softmax Pro من الكمبيوتر لبدء الفحص. لكل عينة بلازما يتم تحليلها ، يتم تحديد وقت تكوين الجلطة وتعريفه على أنه الوقت بالثواني للوصول إلى نصف الحد الأقصى للزيادة في الامتصاص. يتم تعريف المعدل الأولي لتكوين الجلطة على أنه معدل الزيادة في الامتصاص خلال النقاط الزمنية الخمس الأولى من الجزء الخطي من الزيادة في الامتصاص مقابل الوقت.

يتم تعريف مدى تكوين الجلطة على أنه الفرق بين الحد الأقصى والحد الأدنى للامتصاص الذي تم تحقيقه أثناء حدث تكوين الجلطة في نهاية التشغيل. استخدم ملفات تعريف الامتصاص مقابل الوقت في Softmax Pro لتحديد الوقت والمعدل الأولي ومدى تكوين الجلطة للتخفيف التسلسلي للبلازما البشرية العادية. لبناء المنحنيات القياسية لنشاط العامل V في مرحلة واحدة ، استخدم أوقات الجلطة للبلازما البشرية العادية المخففة 40 ضعفا وعينة البلازما المجهولة لأقوم بإاستيفاء نشاط العامل الخامس بوحدات لكل مطحنة من منحنى معيار نشاط المرحلة الخامسة للعامل.

يمثل هذا العامل الخامس نشاط مرحلة واحدة أو ذلك بدون تنشيط متعمد بواسطة الثرومبين. هذا مثال تمثيلي لتكوين جلطة الفيبرين في مقايسة العامل الخامس بمرور الوقت التي تم إنشاؤها بواسطة قارئ الصفيحة الدقيقة. يمثل المظهر الجانبي تكوين جلطة الفيبرين باستخدام 32 ضعفا من البلازما البشرية الطبيعية المخففة في صفيحة دقيقة واحدة.

حسنا ، يشير المحور الرأسي إلى التغيير في المادة الماصة عند 405 نانومتر الذي حدث نتيجة لتكوين جلطة الفيبرين. تم حساب وقت تكوين الجلطة على أنه نقطة منتصف منحنى الامتصاص مقابل الوقت ، 36.4 ثانية. تم حساب المعدل الأولي لتكوين الجلطة على أنه 611.88 ملي وحدة في الدقيقة.

تم حساب مدى تكوين السحب ب 0.35 وحدة. يقيس مقايسة العامل الخامس بدقة المعدل الأولي للوقت ومدى تكوين السحب. أكد فحص الآبار عند اكتمال الفحص حدوث تكوين جلطة.

وصلت جميع التفاعلات إلى نفس المدى تقريبا من تكوين السحابة مع تغيير عام في الامتصاص عند 405 نانومتر بين 0.35 و 0.45 وحدة بين امتصاص البداية قبل وأقصى امتصاص بعد رأب الخثرة وكلوريد الكالسيوم. بالإضافة إلى ذلك ، تذهب أمثلة تمثيلية لنشاط العامل الخامس في مرحلة واحدة ، والمنحنى القياسي لوقت الجلطة بالثواني مقابل نشاط العامل الخامس بالوحدات لكل مل والمعدل الأولي لتكوين المخلب بالوحدات المللية في الدقيقة مقابل العامل خمسة. يظهر النشاط بالوحدات لكل مل للبلازما البشرية العادية في اللوحة A واللوحة B على التوالي.

نظرا لأن العامل الخامس يتم تنشيطه عادة باستخدام الثرومبين. يعد العامل المساعد النشط خمسة أ ، وهو اختبار ثان بعد الجمع والحضانة بالثرومبين أمرا بالغ الأهمية لقياس نشاط العامل الخامس على مرحلتين لعينة البلازما بدقة مع التنشيط المتعمد عن طريق إضافة الثرومبين لمقايسة العامل الخامس على مرحلتين. قم بإعداد 200 إلى 300 ميكرولتر من الثرومبين المنقى بتركيزها النهائي البالغ مائة نانو مولار في HBS pH 7.4 واحتضان على الجليد قم بتخفيف 120 ميكرولتر من البلازما البشرية الطبيعية أعلاه وأخذ عينات من البلازما من 40 ضعفا إلى 100 ضعفا مع 170 ميكرولتر من HBS pH 7.4 تحتوي على 2.8 ملليمولار.

كلوريد الكالسيوم. أضف 10 ميكرولتر من الثرومبين لتحقيق تركيز نهائي 10 نانومولار لكل عينة. دوار. حسنا ، للخلط والحضانة عند 37 درجة لمدة دقيقة واحدة ، قم بتخفيف البلازما البشرية العادية وأخذ عينات من البلازما إلى 500 ضعف عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من HBS pH 7.4.

حدد وقت الجلطة للبلازما البشرية الطبيعية في كل من مقايسة البلازما المجهولة من الامتصاص مقابل ملفات تعريف الوقت في Soft max Pro. مع الأخذ في الاعتبار التخفيف 500 ضعف ، استخدم وقت الجلطة لكل عينة لحساب العامل الخامس نشاط مرحلتين من العامل الخامس منحنى قياسي من مرحلة واحدة من وقت الجلطة مقابل النشاط. يمثل هذا العامل خمسة نشاط مرحلتين أو ذلك مع التنشيط المتعمد بواسطة الثرومبين.

يمكن بعد ذلك حساب إجمالي نشاط العامل الخامس على أنه نشاط العامل الخامس على مرحلتين مطروحا منه العامل الخامس نشاط المرحلة الواحدة. تم استخدام المنحنى القياسي لوقت الجلطة اللوغاريتمية مقابل نشاط عامل السجل الخامس لقياس نشاط العامل الخامس في البلازما البشرية الطبيعية وفي البلازما من تسعة مرضى يعانون من التخثر المنتشر داخل الأوعية الدموية أو DIC ، وجميعهم مرضى DIC التسعة. أظهر العامل الخامس أنشطة المرحلة الواحدة والمعدلات الأولية لتكوين الجلطة التي انخفضت في المتوسط بنسبة 54 و 18٪ انخفض العامل الخامس ومرحلتان والنشاط الكلي في مرضى DIC في المتوسط بنسبة 44 و 42٪ مقارنة بالبلازما البشرية العادية.

أدى العامل الخامس ومرضى DIC إلى وقت طويل وانخفاض معدل تكوين جلطة الألياف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تنفيذ هذه الطريقة في مختبرك. يمكن تكييف الطريقة بسهولة لقياس نشاط أي عامل تخثر في البلازما ، مما يجعلها مناسبة لمجموعة واسعة من الأبحاث والتطبيقات السريرية.

في النهاية ، ستؤثر معلومات العامل الخامس هذه بشكل إيجابي على بيئات الرعاية الصحية من خلال التشخيص والعلاج المبكر لاضطرابات التخثر أو النزيف مثل DIC.