وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا مفردة لإجراء تحليل الترانسكريبتوم القائم على المصفوفات الدقيقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الشبكية وفصلها عن الأنسجة المحيطة، ثم تفكيكها إلى خلايا مفردة. وتتمثل الخطوة الثانية في حصاد الخلايا المفردة وإيداعها في أنابيب PCR تحتوي على محلول منظم للتحلل (lysis buffer).

بعد ذلك، يتم تحلل الخلايا وتضخيم الـ CDNA باستخدام النسخ العكسي، يليه تفاعل البوليميراز المتسلسل. وفي النهاية، يُستخدم تهجين الـ CD NA للخلية الواحدة على مصفوفة AiMatrix مجهرية للكشف عن الـ mRNAs التي يتم التعبير عنها في خلية واحدة. وتتمثل الميزة الرئيسية لتحليل التعبير الجيني في الخلايا المفردة مقابل استخدام طرق الأنسجة الكاملة في أن عزل الخلايا المفردة يتيح لك الوصول إلى مجموعات صغيرة جداً من الخلايا التي قد تشكل النسيج بأكمله.

يمكن أن تكون هذه الخلايا أي شيء، بدءاً من أنواع مختلفة من العصبونات وصولاً إلى مجموعات صغيرة من الخلايا الجذعية. وما تتيحه لنا تقنية الخلية الواحدة تجاه هذه الخلايا هو تحديد كل من أنواع الخلايا، والعلامات المحددة لهذه المجموعات الصغيرة من الخلايا، وتحديد الشبكات الجينية التي يتم التعبير عنها في هذه المجموعات الفرعية النادرة للغاية من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، تتيح لنا تقنية توصيف الخلية الواحدة تحديد الشبكات الجينية التي يتم التعبير عنها بشكل عابر خلال المراحل الانتقالية التطورية الديناميكية للغاية في مجموعات فرعية صغيرة جداً من الخلايا.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الوراثيات التطورية، مثل متى تبدأ الخلايا السلفية في التعبير عن الشبكات الجينية المرتبطة بالتمايز وكيف تختلف تلك الخلايا السلفية عن بعضها البعض. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل العلاجات الخلوية للأمراض التنكسية العصبية مثل المياه الزرقاء (الجلوكوما)، لأنه من خلال توضيح الشبكات الرئيسية في تطور الخلايا الفردية نصبح أقرب بخطوة واحدة من القدرة على توليد تلك الخلايا لاستخدامها في العلاج بالاستبدال الخلوي. ابدأ هذا الإجراء بوضع شبكية عين الفأر في طبق مملوء بـ PBS.

بعد ذلك، قم بإزالة الجسم الزجاجي والعدسة. ثم قم بإزالة جميع خلايا الظهارة الصباغية للشبكية. يتم تحضين الشبكية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter عند 37 degrees Celsius لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بالنقر بلطف على الأنبوب لإزالة أي خلايا مترسبة. ثم قم بعملية الترتيت (trituration) بلطف من 10 إلى 20 مرة باستخدام ماصة P 1000. إذا استمر وجود تجمعات نسيجية كبيرة، قم بحضنها لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 °C ثم كرر عملية الترتيت من 10 إلى 20 مرة.

بعد ذلك، أضف 5 µL من الـ dna، بمعدل 10 units لكل 1 µL إلى الشبكية، ثم قم بتحضينها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتقليب المزيج بلطف باستخدام ماصة P 1000 مرة أخرى من 10 إلى 20 مرة. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 3000 RPM لمدة 3 دقائق.

ثم قم بإزالة الطافي واترك من 100 إلى 200 µL من السائل في القاع. انقر على الأنبوب لإزاحة الراسب. بعد ذلك، أضف 1 mL من HBSS وأعد تعليق الراسب عن طريق الدوران اللطيف.

قم بطردها مركزياً بسرعة 3000 RPM لمدة ثلاث دقائق. وعند الانتهاء، قم بإزالة الطافي بعناية. ثم أعد تعليقها في 450 µL من PBS المحتوي على 0.1%BSA. في الخطوة التالية، جهز طبقين بقطر ستة سنتيمتر يحتوي كل منهما على 5 mL من PBS المدعم بـ 0.1%BSA.

في اللوح التالي، قم بوضع الخلايا المفككة في طبق واحد. اترك الخلايا تستقر لمدة خمس دقائق على الأقل. بعد ذلك، ضع طبق الخلايا المفككة تحت مجهر مقلوب.

استخدم ماصة دقيقة الطرف مع أنبوب شفط لجمع خلية واحدة. بعد ذلك، ضع الماصة الدقيقة بالقرب من الخلية، حيث ستدخل الماصة بسهولة عبر الخاصية الشعرية. ثم قم بطرد الخلية في طبق ثانٍ، وتأكد من جمع خلية واحدة فقط لتحليل التعبير الجيني.

يتم ذلك إما عن طريق إزالة الخلايا الزائدة أو نقل الخلية المراد دراستها إلى موقع مختلف باستخدام ماصة دقيقة جديدة. عندما يتم عزل خلية فردية تماماً عن الخلايا المجاورة، استخدم ماصة دقيقة جديدة لسحب الخلية المراد دراستها. بعد ذلك، قم بطردها مباشرة في أنبوب PCR سعة 0.2 milliliter يحتوي على 4.5 µL من منظم تحليل الخلايا.

قم بتدوير العينة لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق (micro centrifuge) لغمر الخلية في محلول التحلل (lysis buffer). كرر عملية التدوير هذه بعد كل خلية خامسة، ثم مرة أخرى في نهاية عملية الجمع. تذكر إبقاء الأنبوب على الثلج طوال فترة عزل الخلية الواحدة، واجمع الخلايا المفردة خلال نافذة زمنية مدتها ساعتان بعد عملية التفكك للحصول على أفضل النتائج في هذا الإجراء؛ قم بتدوير العينة لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق للتأكد من غمر الخلية الواحدة في محلول تحلل الخلايا.

لتعزيز تحلل الخلايا، يتم تحضين العينة عند 70 degrees Celsius لمدة 90 ثانية في جهاز التدوير الحراري. ثم يوضع الأنبوب فوراً على الثلج لمدة دقيقتين. لإجراء عملية النسخ العكسي، يتم إضافة 0.33 microliters.

أضف 0.05 µL من Superscript three بتركيز 200 units/µL، و0.07 µL من المثبط بتركيز 40 units/µL، وT four gene 32 protein إلى الأنبوب. قم بتحضين خليط التفاعل لمدة 50 دقيقة عند 50 °C في جهاز التدوير الحراري (thermocycler)، وبعد مرور 50 دقيقة، قم بتعطيل الإنزيم عند 70 °C لمدة 15 دقيقة أخرى.

بعد الانتهاء من ذلك، أعد الأنبوب إلى الثلج. ولإزالة البادئ الحر، أضف 0.1 µL من منظم exonuclease بتركيز 10x، و0.8 µL من H2O المقطر، و0.1 µL من إنزيم Exonuclease One بتركيز 20 units/µL إلى الأنبوب، ثم يتم التحضين عند 37 °C لمدة 30 دقيقة في جهاز thermocycler.

بعد مرور 30 دقيقة، قم بتثبيط الإنزيم عن طريق تحضين خليط التفاعل عند 80 °C لمدة 25 دقيقة. وفي النهاية، أعِد الأنبوب إلى الثلج. بعد ذلك، أضف 6 µL من خليط تفاعل التذييل إلى العينة.

قم بتحضينها في الجهاز الدوري الحراري عند 37 °C لمدة 20 دقيقة، ثم عند 70 °C لمدة 10 دقائق، وبعد ذلك تحفظ عند 4 °C. لاحقاً، أضف 10 µL من العينة ذات الذيول إلى خليط تفاعل PCR. قم بإجراء تخليق السلسلة الثانية وتضخيم PCR لوسم CDNA.

من أجل الحصول على تهجين قوي على مصفوفات iMatrix الدقيقة، قم أولاً بتجزئة الـ CD NA عن طريق إضافة 10 إلى 20 µL من الـ CD NA لخلية واحدة إلى 8 µL من محلول منظم 1x 1 for all. ثم أضف 1 µL من هذا الـ DNA المخفف إلى 80 µL من محلول التفاعل. بعد ذلك، أضف 20 µL من محلول منظم 5X TDT، و 2.5 µL من البيوتين و dATP، و 1 µL من TDT المخفف إليه.

بعد ذلك، أضف إلى المزيج 20 µL من XTDT buffer و2.5 µL من biotin و6 µL من D-D-A-T-P و1 µL من TDT. حضّن المزيج لمدة 90 دقيقة عند 37 °C، ثم لمدة خمس دقائق عند 65 °C.

يُخزّن بعد ذلك في درجة حرارة 20- درجة مئوية أو يتم تهجينها فوراً باستخدام مصفوفة a iMatrix الدقيقة. فيما يلي مثال تمثيلي للطخات cDNA أحادية الخلية وتفاعلات PCR النوعية للجينات؛ حيث تحتوي المسارات A-F-G-N-H على لطخات cDNA قوية، بينما المسارات B وC وD وE أقل قوة بشكل ملحوظ. تم عزل الـ cDNAs من خلايا العقدة الشبكية الفلورية، ثم اختُبرت باستخدام بادئات PCR نوعية لعلامات خلايا العقدة الشبكية، BRN3B وPAC6، وتفاعل PCR نوعي لجين علامة المستقبلات الضوئية.

استُخدم CRX لتحديد مستوى التلوث في الخلية المفردة. تم تحديد CDNAs ومجموعات فرعية من خلايا العصبونات العقدية الشبكية من خلال الفحص للكشف عن وجود جين tachy kinin one. تظهر نتائج المصفوفات الدقيقة للجينات المختارة التي تم التعبير عنها في 22 خلية مفردة متميزة بتنسيق خريطة حرارية.

تم قياس كثافة إشارات المصفوفة الدقيقة لتتوافق مع كثافة اللون الأحمر، بينما يشير اللون الأسود إلى غياب الإشارة في المصفوفة الدقيقة. عقب هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق إضافية مثل QPCR لتأكيد نمط التعبير الجيني الذي ظهر في المصفوفة الدقيقة. كما يمكن استخدام نتائج التهجين في C للإجابة على أسئلة إضافية قد تكون لديك حول مواقع الخلايا التي تعبر عن جينات معينة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تفكيك الشبكيات، وعزل الخلايا المفردة، وتوليد cDNA من تلك الخلايا المفردة، وذلك من أجل التهجين على المصفوفات الدقيقة.