وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا المفردة لتحليل النسخ القائم على المصفوفات الدقيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح شبكية العين أولا من الأنسجة المحيطة ثم تفكيكها إلى خلايا مفردة. الخطوة الثانية هي حصاد الخلايا المفردة وإيداعها في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تحتوي على عازل التحلل.

ثم يتم تحلل الخلايا ويتم تضخيم CDNA باستخدام النسخ العكسي ، متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل. في النهاية ، يتم استخدام تهجين CD NA أحادي الخلية على مصفوفة دقيقة A iMatrix للكشف عن mRNAs المعبر عنها في خلية واحدة. الميزة الرئيسية لتنميط التعبير الجيني في الخلايا المفردة مقابل استخدام مناهج الأنسجة الكاملة هي أن عزل الخلية المفردة يسمح لك بالوصول إلى مجموعات صغيرة جدا من الخلايا التي قد تشكل الأنسجة بأكملها.

يمكن أن تكون هذه الخلايا أي شيء من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية إلى مجموعات صغيرة من الخلايا الجذعية. ما تسمح لنا تقنية الخلية المفردة بالقيام به لهذه الخلايا هو تحديد كلا النوعين من الخلايا ، وعلامات محددة لهذه المجموعات الصغيرة من الخلايا ، وتحديد شبكات الجينات التي يتم التعبير عنها في هذه المجموعات الفرعية النادرة للغاية من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح لنا تقنية التنميط أحادي الخلية بتحديد شبكات الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل عابر أثناء التحولات التنموية الديناميكية للغاية في مجموعات فرعية صغيرة جدا من الخلايا.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الوراثة التنموي ، مثل عندما تبدأ الخلايا السلفية في التعبير عن شبكات الجينات المرتبطة بالتمايز وكيف تختلف تلك الخلايا السلفية عن بعضها البعض. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاجات الخلوية للأمراض التنكسية العصبية مثل الجلوكوما ، لأنه من خلال توضيح الشبكات الرئيسية في تطوير الخلايا الفردية ، فإننا نقترب خطوة واحدة من القدرة على توليد تلك الخلايا لاستخدامها في العلاج البديل الخلوي. ابدأ هذا الإجراء بوضع شبكية العين في طبق مليء ب PBS.

بعد ذلك ، قم بإزالة الجسم الزجاجي والعدسة. ثم قم بإزالة كل ظهارة صبغة الشبكية. احتضان شبكية العين في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، اضغط برفق على الأنبوب لإخراج أي خلايا مستقرة. ثم قم بتقييمه بلطف ، من 10 إلى 20 مرة باستخدام ماصة P 1000. إذا استمرت كتل كبيرة من الأنسجة ، احتضنها لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية ثم ضعها في الثلاجة من 10 إلى 20 مرة.

بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من الحمض النووي ، واحدة بمقدار 10 وحدات لكل ميكرولتر إلى شبكية العين ، واحتضنها لمدة خمس دقائق. في جهاز التنظيف في درجة حرارة الغرفة، قم بتقييمه برفق باستخدام ماصة P 1000 مرة أخرى لمدة 10 إلى 20 مرة أخرى بعد ذلك. قم بجهاز الطرد المركزي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق.

ثم قم بإزالة المادة الطافية واترك 100 إلى 200 ميكرولتر من السائل في الأسفل. اضغط على الأنبوب لإخراج الحبيبات. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من HBSS وأعد تعليق الحبيبات بدرجة حرارة لطيفة.

قم بجهاز الطرد المركزي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. عند الانتهاء ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية. ثم إعادة التشكيل ، قم بتعليقه في 450 ميكرولتر من PBS يحتوي على 0.1٪ BSA في الخطوة التالية ، قم بإعداد طبقين بحجم ستة سنتيمترات يحتويان على خمسة ملليلتر من PBS مكملة ب 0.1٪ BSA.

الطبق التالي ، الخلايا المنفصلة في طبق واحد. اسمح للخلايا بالاستقرار لمدة خمس دقائق على الأقل. بعد ذلك ، ضع طبق الخلايا المنفصلة تحت المجهر المقلوب.

استخدم ماصة ذات رؤوس دقيقة مع أنبوب شفاط لحصاد خلية واحدة. ثم ضع الماصة الدقيقة بالقرب من الخلية وستدخل بسهولة الماصة الدقيقة عن طريق عمل شعري. بعد ذلك ، طرد الخلية إلى طبق ثان وتأكد من حصاد خلية واحدة فقط لتنميط التعبير الجيني.

يتم ذلك إما عن طريق إزالة الخلايا الدخيلة أو نقل الخلية ذات الأهمية إلى موقع مختلف باستخدام ماصة دقيقة جديدة. عندما يتم عزل خلية فردية تماما عن الخلايا المجاورة ، استخدم ماصة دقيقة جديدة لشفط الخلية محل الاهتمام. بعد ذلك ، قم بطرده مباشرة في أنبوب PCR سعة 0.2 مليلتر يحتوي على 4.5 ميكرولتر مخزن مؤقت لتحلل الخلايا.

قم بتدوير العينة لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير لغمر الخلية في المخزن المؤقت للتحلل. قم بهذا الدوران بعد كل خلية خامسة ثم مرة أخرى في نهاية المجموعة. تذكر أن تبقي الأنبوب على الجليد طوال مدة عزل الخلية المفردة وجمع الخلايا المفردة في غضون ساعتين بعد التفكك للحصول على أفضل النتائج في هذا الإجراء ، قم بتدوير العينة لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق للتأكد من أن الخلية المفردة مغمورة في المخزن المؤقت لتحلل الخلية.

لتعزيز تحلل الخلايا ، احتضان العينة عند 70 درجة مئوية لمدة 90 ثانية في جهاز التدوير الحراري. ثم ضع الأنبوب على الفور مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقتين. لإجراء النسخ العكسي ، أضف 0.33 ميكرولتر.

مرتفعة عند 200 وحدة لكل ميكرولتر 0.05 ميكرولتر مثبط بمعدل 40 وحدة لكل ميكرولتر و 0.07 ميكرولتر. T أربعة جين 32 بروتين إلى الأنبوب. احتضان خليط التفاعل لمدة 50 دقيقة عند 50 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري بعد 50 دقيقة ، وقم بتعطيل الإنزيم عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى.

عند الانتهاء من ذلك ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد. لإزالة التمهيدي المجاني ، أضف 0.1 ميكرولتر 10 × عازلة نوكلياز خارجي ، 0.8 ميكرولتر ، D H2O و 0.1 ميكرولتر. نوكلياز خارجي ، واحد عند 20 وحدة لكل ميكرولتر إلى الأنبوب المحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الدراجة الحرارية.

بعد 30 دقيقة ، قم بتعطيل الإنزيم عن طريق احتضان خليط التفاعل عند 80 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. في النهاية ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد. بعد ذلك ، أضف ستة ميكرولترات من خليط تفاعل المخلفات إلى العينة.

احتضنها في جهاز التدوير الحراري عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم احتفظ بها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من العينة الخلفية إلى خليط تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بإجراء تخليق الخيط الثاني وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسمية CDNA.

من أجل الحصول على تهجين قوي على المصفوفات الدقيقة iMatrix ، قم أولا بتجزئة CD NA عن طريق إضافة 10 إلى 20 ميكرولترا من CD NA أحادي الخلية إلى ثمانية ميكرولتر واحد × واحد لكل المخزن المؤقت. ثم أضف ميكرولتر واحد من هذا الحمض النووي المخفف إلى محلول تفاعل 80 ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا ، وخمسة عازلة XTDT ، و 2.5 ميكرولتر من البيوتين ، وستة D-D-A-T-P وميكرولتر واحد TDT مخفف إليها.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا ، وخمسة مخزن مؤقت XTDT ، و 2.5 ميكرولتر ، والبيوتين ، وستة D-D-A-T-P وميكرولتر TDT واحد إليها. احتضن الخليط لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم خمس دقائق عند 65 درجة مئوية.

قم بتخزينه بعد ذلك عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر أو قم بتهجينها على الفور إلى مصفوفة دقيقة iMatrix. فيما يلي مثال تمثيلي لمسحات CD NA أحادية الخلية وممرات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة بالجينات تحتوي A-F-G-N-H على مسحات CD NA قوية بينما تكون الممرات B و C و D و E أقل قوة بكثير. تم عزل CDNAs من خلايا العقدة الشبكية الفلورية ، ثم تم اختبارها باستخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة بعلامات الخلايا العقدية الشبكية ، BRN three B و PAC six ، PCR الخاص بالجين لعلامة المستقبلات الضوئية.

تم استخدام CRX لتحديد مستوى التلوث في الخلية الواحدة. تم تحديد CDNAs ومجموعات فرعية من الخلايا العقدية الشبكية عن طريق فحص وجود جين كينين تسرع الشبكية. يتم عرض نتائج المصفوفات الدقيقة للجينات المختارة المعبر عنها في 22 خلية مفردة مميزة بتنسيق خريطة حرارية.

تم تحجيم الشدة من إشارات المصفوفة الدقيقة لتتوافق مع شدة اللون الأحمر ، بينما يشير اللون الأسود إلى عدم وجود إشارة على المصفوفة الدقيقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق إضافية مثل QPCR لتأكيد نمط التعبير الجيني الذي يظهر في الأشعة الدقيقة. يمكن أيضا استخدام نتائج تهجين C للإجابة على أسئلة إضافية قد تكون لديك حول مواقع الخلايا التي تعبر عن جينات معينة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية فصل شبكية العين وعزل الخلايا المفردة وتوليد CDNA من تلك الخلايا المفردة. للتهجين على المصفوفة الدقيقة.