المحلية والعالمية طرق تقييم Nociception الحرارية في ذبابة الفاكهة يرقات

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس الاستقبال الحراري للألم في يرقات الدروسوفيلا. ويتم تحقيق ذلك عن طريق جمع يرقات الدروسوفيلا لتعريضها لاحقاً لمحفزات حرارية مؤلمة، وفي خطوة ثانية اختيارية، يمكن تعريض اليرقات للإشعاع فوق البنفسجي (UV)، مما يتسبب في تلف الأنسجة وزيادة الحساسية تجاه الألم الحراري. بعد ذلك، يمكن فحص اليرقة موضعياً باستخدام مسبار حراري أو بشكل عام باستخدام صفيحة تسخين لاستثارة استجابات استقبال الألم التي يمكن قياسها كمياً.

يُظهر مسبار الحرارة أن اليرقات لديها سقف للاستجابة المستقبلة للألم تجاه الحرارة، وعلاقة مفاجئة بين درجة حرارة المدخلات وسعة الاستجابة المستثارة. كما يوضح اختبار الصفيحة الحرارية أن اليرقات تظهر تسلسلاً نمطياً من السلوكيات المستقبلة للألم والتي تعتمد على درجة حرارة الماء المحيط ونشاط العصبونات الحسية المستقبلة للألم. يمكن للطرق الموصوفة هنا أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال استقبال الألم الحراري، مثل ما إذا كانت الحيوانات تستجيب بشكل مختلف للمنبهات الحرارية الضارة التي يتم تقديمها إما موضعياً أو بشكل شامل.

عادةً ما يواجه الأشخاص المبتدئون في اختبار مسبار الحرارة صعوبة في البداية، لأن إتقان هذا الاختبار يتطلب ممارسة لتقليل التباين في الضغط، والموقع، وزاوية توجيه المسبار المستخدم. ويعد العرض المرئي لاختبار صفيحة الحرارة أمراً بالغ الأهمية، حيث يجب رؤية السلوكيات المستحثة مع ارتفاع درجة الحرارة لتقديرها بشكل أفضل. وللحصول على عدد كافٍ من اليرقات الناتجة ذات النمط الجيني المحدد المطلوب، يتم تربية السلالة المطلوبة مباشرة أو إجراء عمليات تزاوج في زجاجات تحتوي على غذاء الذباب باستخدام 20 إلى 30 أنثى عذراء و15 إلى 20 ذكراً. وبعد خمسة أيام من وضع البيض، يتم جمع وتنظيف يرقات الطور الثالث المبكر عن طريق إزالة غذاء الذباب اللين وتصفيتها بمياه جارية بلطف عبر مصفاة ذات حجم مسام 630 micron، ثم تُنقل يرقات الطور الثالث المبكر إلى قطعة صغيرة ورطبة من الغذاء لمنع الجوع والجفاف.

بعد تجهيز غرفة التخدير، استخدم الملقط أو فرشاة رسم لوضع 10 يرقات في بداية الطور الثالث بعناية على طول الجانب الداخلي للغطاء ثم أغلقه. وبالعمل داخل خزانة استخراج الأدخنة، ضع غرفة التخدير داخل جرة ربط تحتوي على دورق سعة 10 milliliter بداخله كرة قطنية مبللة بـ 1.5 milliliters من dathyl ether. أحكم إغلاق غطاء جرة الربط لتعريض اليرقات لأبخرة الإيثر لمدة تتراوح بين دقيقتين و 2.5 دقيقة.

بعد التخدير، قم بإزالة غرفة التخدير من وعاء كوبلان (Coplan) واتركها لبضع ثوانٍ داخل خزانة سحب الأدخنة (الـ hood) لتبدد أي أبخرة إيثر متبقية. استخدم زجاجة رش المياه لشطف اليرقات بلطف من غرفة التخدير ونقلها إلى طبق بتري صغير. جفف اليرقات المخدّرة باستخدام ورق ترشيح، ثم ثبتها بلطف بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى على شريط من الشريط اللاصق ذو الوجهين مثبت على شريحة مجهرية زجاجية مقاس ثلاث بوصات في بوصة واحدة.

ضع الشريحة على السطح السفلي لغرفة التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية، وعرّض اليرقات للأشعة فوق البنفسجية لمدة ست ثوانٍ بكثافة 20 millijoules per centimeter squared. بعد التشعيع، اغمر الشريحة في الماء لجعل اليرقات تطفو برفق بعيداً عن شريط السكوتش مزدوج الوجه. استخدم ملقطاً أو فرشاة رسم لوضع اليرقات المشععة برفق في وعاء قياسه 15 by 45 millimeter.

قارورة زراعة زجاجية سعة درام واحد تحتوي على ملليلتر واحد من غذاء الذباب لاستردادها لمدة تتراوح من 8 إلى 24 ساعة عند 25 درجة مئوية أو درجة حرارة الزراعة المطلوبة قبل إعادة استضافتها. بالنسبة لمقاييس استقبال الألم الحراري، قم أولاً بضبط درجة حرارة المسبار الحراري على النقطة المحددة المطلوبة. استخدم فرشاة رسم أو ملقط لنقل يرقة واحدة برفق إلى منصة مسطحة، مع التأكد من أن اليرقة مغطاة بطبقة رقيقة من الماء.

من أجل تقليل التباين في الضغط وضمان الموضع والزاوية الصحيحين لمسبار الحرارة، فإن الممارسة المستمرة تؤدي إلى الإتقان. اضغط برفق بطرف المسبار على اليرقات عند القطعة A four، مع تطبيق ضغط خفيف بحيث تكون الزاوية بين المسبار وسطح اليرقة حوالي 45 درجة. يجب أن يتسبب هذا الضغط في إحداث انبعاج طفيف على سطح اليرقة، وعادة ما يكون ذلك كافيًا لمنع الحركة.

استمر في تحفيز اليرقات حتى تظهر استجابة انسحابية أو حتى الوصول إلى الحد الزمني النهائي الثاني والعشرين. تظهر اليرقات المستجيبة عادةً في البداية سلوكًا تمهيديًا يتمثل في رفع الرأس والذيل، يليه سلوك الانسحاب المتمثل في التدحرج بزاوية 360 درجة على الأقل. وبمجرد بدء سلوك الانسحاب، ارفع المسبار عن اليرقة وسجل فترة الكمون أو الوقت المستغرق للانسحاب.

إذا لم يُلاحظ أي سلوك انسحاب خلال 20 ثانية، فإن اليرقة تعتبر غير مستجيبة. قم بتوجيه أدلة الضوء بالألياف الضوئية لضمان وجود إضاءة ذات تباين عالٍ وكافية. لعرض اليرقات، ضع كتلة التسخين في الصفيحة الحرارية بحيث يكون السطح المستوي للأعلى، ثم ضع الصفيحة الحرارية على قاعدة المجهر.

قم بتشغيل لوح التسخين على الإعداد العالي واتركه لمدة 15 دقيقة تقريباً حتى تستقر درجة الحرارة عند 95 °C. قم بقياس 80 µL من الماء المقطر وضع قطرة الماء في منتصف طبق بتري من البولي ستيرين بمقاس 60 في 15 mm باستخدام ماصة دقيقة. استخدم الملقط لوضع يرقات نظيفة في طور طور اليرقة الثالث الأوسط برفق في منتصف قطرة الماء، مع الحرص على إدخال أقل قدر ممكن من الماء الإضافي.

ضع طبق بتري برفق فوق كتلة التسخين الصلبة الموجودة على الصفيحة الساخنة. قم بتعديل موقع الطبق بسرعة بحيث تكون اليرقات بالكامل وقطرة الماء في مجال الرؤية. ابدأ تشغيل المؤقت.

في هذه اللحظة، يتم وضع طبق بتري على الكتلة التسخينية الصلبة للصفيحة الحرارية وتسجيل وقت بدء كل سلوك. تظهر سلوكيات حركية نمطية عند نقل اليرقة المغمورة في الماء إلى الصفيحة الحرارية. يتضمن السلوك الطبيعي في غياب الحرارة الحركة المظلية، المصحوبة بحركات بحثية للرأس.

يمكن أن يحدث سلوك اهتزاز الرأس بعد ذلك، حيث تحرك اليرقة رأسها بسرعة في حركة أمامية أو جانبية. تشبه هذه الحركة حركتها الطبيعية في الماء، ولكنها تحدث بشكل أكثر تشنجاً ومع تدحرج مستمر. يحدث هذا السلوك عندما تتدحرج اليرقات جانبياً بمقدار 360 درجة كاملة على الأقل.

يمكن أن يحدث هذا عدداً متغيراً من المرات، ويتضمن أحياناً دورانات غير مكتملة. ولغرض تسجيل هذا السلوك، يتم حساب الدورانات الكاملة بزاوية 360 درجة فقط. ويُعد هذا السلوك هو الأكثر تشابهاً مع ذلك المشهد الذي يتضمن التطبيق الموضعي لمسبار الحرارة أثناء سلوك السوط.

تُظهر اليرقة حركات انقباض وانبساط سريعة على طول المحور الأمامي الخلفي تجعل الرأس يقترب لفترة وجيزة جداً من الذيل. وغالباً ما يُلاحظ السوط (Whipping) في تتابع سريع، أو في نفس وقت حدوث الدوران (rolling). وأخيراً، ستظهر اليرقة سلوك التشنج الذي يتبعه غالباً الشلل. وخلال سلوك التشنج، تتمدد اليرقة على طول المحور الأمامي الخلفي وتُظهر اهتزازاً عالي التردد في كامل الجسم.

يحدث سلوك الارتجاف دون شلل الانحناء عندما تتوقف اليرقات عن الحركة. يكون هذا السلوك دائماً في بعض اليرقات، بينما تظهر يرقات أخرى حركة نبضية منخفضة التردد. وفي هذا المخطط البياني للنسبة المئوية للمستجيبين المنتمين إلى كل فئة، يوجد سقف لاستجابة اليرقات للإدراك الحراري للألم. ففي اختبار مسبار الحرارة، تكون 100% من اليرقات مستجيبة سريعة حتى تصل درجة حرارة المسبار إلى 52 degrees Celsius.

ومع ذلك، عند درجة حرارة 54 °C أو أعلى، يفشل 90% أو أكثر من اليرقات في الاستجابة حتى بعد 20 ثانية من التلامس. ورغم أن هذه اليرقات تستمر في الحركة بعد نقطة القطع الثانية والعشرين، إلا أنه يمكن أيضاً قياس ورسم عدد الدورات أو الوقت المستغرق في سلوك الانسحاب النفوري. ومن المثير للدهشة أن هناك علاقة عكسية تظهر بين درجة حرارة المسبار وقوة الاستجابة، حيث يبدو أن درجات الحرارة المنخفضة تحفز عدداً أكبر من الدورات.

تُلاحظ خمسة سلوكيات حركية نمطية عند نقل اليرقة المغمورة في الماء إلى الصفيحة الحرارية. وتظهر هنا متوسطات فترات الكمون التي لوحظت عندها هذه السلوكيات، بالإضافة إلى متوسط درجات حرارة قطرات الماء المقاسة لكل فترة كمون تحت ظروف الفحص المثالية الموضحة هنا، وتراوحت نسبة اليرقات التي أظهرت كل سلوك متميز من 77 إلى 100%، على الرغم من أن سلوكي الدحرجة والضرب يُحذَفان أحيانًا، أو يتداخلان، أو يحدثان بترتيب عكسي، كما تظهر هنا نسبة اليرقات التي نجت بعد بدء سلوك الشلل في فحص الصفيحة الحرارية. تم تسخين اليرقات حتى حدوث الشلل ثم نُقلت إلى ظروف الزرع القياسية للتعافي.

تلقّت اليرقات التي خضعت للمعاملة الصورية معاملة مكافئة باستثناء التعرض للحرارة، وكان تكوين PPE في البالغين القابلين للحياة كميّاً من اليوم السابع إلى اليوم 13. هنا، يقوم MD G four بتحفيز تعبير الجينات المنقولة التي ينظمها UAS في جميع الفئات الأربع من العصبونات الحسية الطرفية متعددة التغصنات. ويقوم UAS or one delta C بالتعبير عن نسخة معدلة من قناة البوتاسيوم المفتوحة المقومة في ذبابة drosophila والضرورية للنقل التشابكي، بينما يقوم UAS orrc one delta NC بالتعبير عن نسخة معدلة إضافية من القناة نفسها لا تتداخل مع النقل التشابكي.

لاحظ أن اليرقات التي تحمل كلًا من محرك MD GALF وtransgene UAS ORC one delta C فقط هي التي تظهر زيادة في فترات الكُمون لأربعة من السلوكيات الخمسة الملحوظة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الاستجابات المحلية والعامة ليرقات GEs تجاه المحفزات الحرارية الضارة. يمكن دمج هذه الإجراءات مع طرق أخرى مثل التحليل الجيني لتحديد الجينات المطلوبة للاستقبال الحراري للألم. عند إجراء اختبار المسبار الحراري، من المهم تذكر تقليل التباين في الضغط، والموقع، وزاوية تلامس المسبار.